Research and Development Project of the German Federal Environmental Agency FKZ: 204 67 458 Technical Report: Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur Messung der Bioakkumulation in terrestrischen Organismen mittels eines internationalen Ringtests) Authors: Philipp Egeler, Daniel Gilberg, Adam Scheffczyk, Thomas Moser, Jörg Römbke ECT Oekotoxikologie GmbH Böttgerstr. 2-14 D-65439 Flörsheim/Main ON BEHALF OF THE GERMAN FEDERAL ENVIRONMENTAL AGENCY January 2009 2 Berichts - Kennblatt 1. Berichtsnummer 2. 3. UBA-FB 204 67 458 4. Titel des Berichts Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten) 5. Autor(en) (Name, Vorname(n)) 6. Abschlussdatum Egeler, Philipp; Gilberg, Daniel; Scheffczyk, Adam; 15. November 2007 Moser, Thomas; Römbke, Jörg 8. Durchführende Institution(en) (Name, Adresse) 7. Veröffentlichungsdatum ECT Oekotoxikologie GmbH 9. UFOPLAN-Nr. Böttgerstr. 2-14 10. Seitenzahl 75 D-65439 Flörsheim/Main 11. Literaturangaben 35 12. Fördernde Institution(en) (Name, Adresse) 13. Tabellen und Diagramme Umweltbundesamt, Wörlitzer Platz 1, 06844 Dessau 31 14. Abbildungen 6 15. Zusätzliche Angaben 16. Zusammenfassung/Kurzfassung Aufgabe des Vorhabens war die Organisation und Durchführung eines internationalen Ringtests mit dem vor einigen Jahren im Auftrag des Umweltbundesamtes entwickelten Bioakkumulationstest mit terrestrischen Oligochaeten. Dabei sollten bestehende Kenntnisse, insbesondere die UBA-Berichte F + E 206 03 909 (1997) und 298 64 416 (2001) berücksichtigt werden. Auf Basis der Ergebnisse eines Startworkshops wurde eine Prüfvorschrift erstellt, anhand welcher der Test bei den einzelnen Ringtestteilnehmern durchgeführt wurde. Insgesamt nahmen 14 Institutionen (Behörden, Universitäten, Auftragslabors und Industrie) aus 7 Ländern am Ringtest teil. Lumbriciden (Eisenia fetida, E. andrei) und Enchyträen (Enchytraeus albidus, E. crypticus) wurden als Testorganismen verwendet. Als Testsubstanzen wurden 14C-markiertes Hexachlorobenzol (HCB) und Cadmiumchlorid ausgewählt. Die Einzeltests wurden je einmal pro Teilnehmer durchgeführt und bestanden aus einer Aufnahme- und einer Eliminationsphase. Insgesamt wurden 33 Tests durchgeführt und vollständig ausgewertet. Während des Ringtests wurden mehrere Workshops sowie ein praktisches Training der Teilnehmer organisiert. Die Aufnahme- und Eliminationskinetik der einzelnen Tests wurde mittels nichtlinearer Regressionsanalyse ausgewertet. Im Anschluss wurden in einer Gesamtschau die Vergleichbarkeit und Variabilität der Testergebnisse sowie zentrale Aspekte der Testmethodik ausgewertet und im Rahmen eines Workshops von den Ringtestteilnehmern diskutiert. Anhand dieser Auswertung wurden die am besten geeigneten Endpunkte und die Randbedingungen für ein adäquates Testdesign festgelegt sowie die vorläufigen Validitätskriterien überprüft. Nach Auswertung des Ringtests wurde ein Richtlinienentwurf entsprechend OECD-Format formuliert, der im Anschluss an das Vorhaben bei der OECD eingereicht werden kann. 17. Schlagwörter Bioakkumulation, Boden, Oligochaeten, Testrichtlinie, Ringtest 18. Preis 19. 20. UBA-F+E-Berichtskennblatt 06/2000 3 Document Control Sheet 1. Report No. 2. 3. UBA-FB 204 67 458 4. Report Title Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten) 5. Author(s) (Family Name(s), First Name(s)) 6. Report Date Egeler, Philipp; Gilberg, Daniel; Scheffczyk, Adam; November 15, 2007 Moser, Thomas; Römbke, Jörg 8. Performing Organisation(s) (Name, Address) 7. Publication Date ECT Oekotoxikologie GmbH 9. UFOPLAN-Ref. Nr. Böttgerstr. 2-14 10. No. of Pages 75 D-65439 Flörsheim/Main 11. No. of References 35 12. Funding Agency (Name, Address) 13. No. of Tables and Diagrams Umweltbundesamt, Wörlitzer Platz 1, 06844 Dessau 31 14. No. of Figures 6 15. Supplementary Notes 16. Abstract The aim of the project was the validation of a soil bioaccumulation test with endobenthic oligochaetes by an international ring test. The test method was developed taking into account existing methods (UBA-reports 206 03 909 (1997) and 298 64 416 (2001)). A test protocol was prepared and used to run the test. A total of 14 institutions (governmental, universities, contract laboratories and industry) from 7 different countries participated in the ring test. Lumbricids (Eisenia fetida, E. andrei) and enchytraeids (Enchytraeus albidus, E. crypticus) were used as test species. The test compounds were 14C-labelled hexachlorobenzene (HCB) and cadmium chloride. The ring test runs were performed once by each laboratory, and consisted of an uptake and an elimination phase. Analysis of total radioactive residues and Cd-concentrations in soil, and tissue samples was performed. In total, 33 tests were performed, and evaluated. Several courses and workshops were organised to inform and train the participants. In a first step following practical ring-testing, the kinetic results of the single test runs were evaluated by nonlinear regression analysis. Additionally, comparability and variability of the results, as well as advantages and difficulties of the method were assessed and discussed by the ring test participants at a workshop. The outcome of the workshop was used to refine evaluation of the results and the test methodology, to define the most appropriate endpoints, the prerequisites for establishing a suitable test design and the validity criteria of this test. As a major outcome of the ring test, the draft test guideline, which closely follows formal requirements of the OECD test guidelines, was updated and prepared for submission to OECD`s Test Guideline Programme. 17. Keywords Bioaccumulation, Soil, Oligochaetes, Test Guideline, Ring Test 18. Price 19. 20. Report Cover Sheet 06/2000 4 Contents Page 1 Introduction ............................................................................................................ 9 2 Organisation of the Ring Test .............................................................................. 11 2.1 Ring Test Participants ................................................................................. 11 2.2 Co-ordinating Institute ................................................................................. 12 2.3 Monitoring ................................................................................................... 12 2.4 Distribution of Materials ............................................................................... 13 3 Acknowledgements .............................................................................................. 13 4 Practical Performance of the Ringtest - Test Methods ......................................... 13 4.1 Test Organisms ........................................................................................... 15 4.2 Culture Conditions ....................................................................................... 16 4.3 Soil .............................................................................................................. 16 4.3.1 Artificial Soil ............................................................................................. 16 4.3.2 Field Soils ................................................................................................ 17 4.4 Determination of Soil pH, Moisture and Organic Carbon Content (TOC) ..... 21 4.5 Determination of Soil Water Holding Capacity (WHC) ................................. 22 5 Test Substances .................................................................................................. 23 5.1 Hexachlorobenzene (HCB) .......................................................................... 23 5.1.1 Method of Spiking .................................................................................... 24 5.1.2 Test Apparatus ........................................................................................ 24 5.1.3 Radio-chemical Analysis .......................................................................... 25 5.2 Cadmium ..................................................................................................... 28 5.2.1 Method of Spiking .................................................................................... 28 5.2.2 Chemical Analysis ................................................................................... 29 5.3 Equilibration and Addition of Food ............................................................... 30 5.4 Measurement Endpoints .............................................................................. 31 6 Experimental Procedures and Methods ............................................................... 32 6.1 General Aspects: Test Vessels, Loading, Replicates ................................... 32 6.2 Test Set-up .................................................................................................. 33 6.3 Addition of the Test Organisms ................................................................... 33 6.4 Duration of Uptake and Elimination Phase .................................................. 34 6.4.1 Maintenance during the exposure period ................................................. 36 6.4.2 Sampling Procedures .............................................................................