Escuela de Bioquímica Profesor Patrocinante Dr. Jaime Figueroa V. Instituto de Bioquímica Facultad de Ciencias CLONAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE UNA SECUENCIA GÉNICA DEL PEZ CYPRINUS CARPIO Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y al Título profesional de Bioquímico ANDREA ALEJANDRA HIDALGO FIGUEROA VALDIVIA – CHILE 2003 Cristo el principio de todo. El es la imagen del Dios que no se puede ver, y para toda criatura es el Primogénito, porque en él fueron creadas todas las cosas, en el cielo y la tierra. Todo fue hecho por medio de él y para él. El existía antes que todos, y todo se mantiene en él. A mis padres Gregoria y Alfonso, por estar siempre conmigo, por enseñarme tantas cosas… A mi hermana, Carolina, por su fortaleza y compañía… Y... a todos mis verdaderos amigos. Agradecimientos Mis primeras palabras de agradecimiento son para mi familia, en especial a mis padres, por su cariño incondicional y por instarme siempre a seguir adelante, a mi hermana Carolina por su compañía, y a mi abuelita Ana por su apoyo y cariño. Al Dr. Jaime Figueroa, de la Universidad Austral de Chile, por permitirme formar parte de su grupo de trabajo, guiarme y apoyarme en esta importante etapa de mi formación profesional. A la Dra. Gudrum Kausel, por sus consejos, apoyo y disponibilidad durante la realización de esta tesis. Al Dr. Carlos Figueroa, por aceptar formar parte de la comisión de mi tesis. En general a todos mis compañeros del laboratorio, en especial a Carlos Flores y Jessica Molina por su ayuda durante la primera etapa del trabajo de esta tesis. A Marcelo Zalazar por su constante apoyo durante el desarrollo de mi tesis. A mis mejores amigas, Anita Canales, Kattina Zavala y Nadya Baéz. por nuestra amistad a lo largo de estos años. También un agradecimiento cariñoso a Carolina Álvarez y Paula Zalazar. Además agradezco a Claudia R., Andrea L. Cecilia C, Damaris V. y Verito por su constante apoyo y amistad. Un agradecimiento muy especial a todos mis amigos de la Parroquia Catedral, en especial al padre Tibaldo Zolezzi por sus consejos y apoyo en los momentos oportunos. A César por su amistad, compañía y apoyo incondicional en mis buenos y malos. No puedo dejar de nombrar a Mauricio B., Doris B., y Pauly por entregarme su amistad durante este año. A mi tía Mary.... Esta tesis fue financiada por el proyecto 1990710 del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, FONDECYT. I INDICE DE CONTENIDOS Página INDICE DE CONTENIDOS I INDICE DE FIGURAS IV LISTA DE ABREVIATURAS VIII 1. RESUMEN 1 SUMMARY 2 2. INTRODUCCIÓN 3 3. MATERIAL Y MÉTODOS 12 3.1 Materiales 12 3.1.1 Reactivos 12 3.1.2 Animales de experimentación 12 3.1.3 Oligonucleótidos 13 3.3 Métodos 13 3.3.1 Reacción de la polimerasa en cadena (PCR) 14 3.2.2 Marcaje radiactivo de la sonda 15 3.2.2.1 Marcaje por PCR 15 3.2.2.2 Medición de la radiactividad incorporada 16 3.2.3 Cultivo de fago lambda en medio sólido 16 3.2.4 Rastreo biblioteca genómica: Primera ronda 17 3.2.4.1 Rondas sucesivas del rastreo de la biblioteca genómica 19 3.2.5 Preparación de DNA viral por el método CTAB 19 II 3.2.6 Cuantificación del DNA 21 3.2.7 Digestiones del DNA con enzimas de restricción 21 3.2.8 Fraccionamiento de DNA en geles de agarosa 20 3.2.9 Subclonamiento de fragmentos de DNA en un vector plasmidial 22 3.2.10 Preparación de células competentes 23 3.2.11 Transformación de células competentes 24 3.2.12 Preparación de DNA plasmidial por lisis alcalina 25 3.2.13 Southern blot en membrana de nylon 26 3.2.14 Hibridación de DNA con una sonda radiactiva 26 3.2.15 Preparación de RNA total de varios tejidos de carpa 27 3.2.16 Fraccionamiento de RNA en geles denaturantes de agarosa con Formaldehido 28 3.2.17 Northern blot en membrana de nylon 29 4. RESULTADOS 30 4.1 Obtención de la sonda GK-310 30 4.2 Rastreo de la biblioteca genómica de carpa 30 4.3 Caracterización de los clones lambda por digestiones con enzimas de restricción 33 4.4 Subclonamiento de los clones lambda 49 4.4.1 Subclonamiento del clon λcGK423 49 4.4.2 Subclonamiento del clon λcGK1012 51 III 4.4.3 Mapa físico de los subclones de calicreína glandular de carpa 51 4.4.3.1 Caracterización del subclon pcGK4232200 por digestiones con enzimas de restricción 51 4.4.3.2 Análisis de la secuencia del subclon pcGK4232200 57 4.4.4 Obtención de una sonda específica para Nothern blot 64 4.4.4.1 Análisis de Northern blot 64 5. DISCUSIÓN 70 6. BIBLIOGRAFÍA 80 IV INDICE DE FIGURA Página Figura 1 31 Secuencia sonda GK310 Figura 2 32 Fraccionamiento de del fragmento de 310pb usado como sonda. Figura 3 34 Análisis de Southern blot de digestiones simples de λcGK423. Figura 4 37 Análisis de Southern blot de digestiones dobles de λcGK423. Figura 5 40 Análisis de Southern blot de digestiones simples de λcGK814 Figura 6 42 Análisis de Southern blot de digestiones dobles de λcGK814 Figura 7 45 Análisis de Southern blot de digestiones simples de λcGK1012 Figura 8 47 Análisis de Southern blot de digestiones dobles de λcGK1012 Figura 9 50 Subclones pcGK4232200 V Figura 10 52 Subclones pcGK10124000. Figura 11 54 Análisis por Southern blot del fraccionamiento con enzimas de restricción del subclon pcGK4232200 Figura 12 56 Caracterización del subclon pcGK4232200 Figura 13 58 Mapa de restricción del subclon pcGK4232200. Figura 14 59 Secuencia subclon pcGK4232200. Figura 15 63 Alineamiento de la secuencia del pcGK4232200 con el cDNA de α-tubulina de Oncorhynchus keta (Salmón chum). Figura 16 66 Alineamiento de la secuencia del fragmento de 2200pb del subclon pcGK4232200 con la sonda GK310 Figura 17 67 Amplificación del fragmento de 2200pb del subclon pcGK4232200 2200pb del subclon pcGK423 VI Figura 18 69 Análisis por Northern blot con un fragmento de 2200pb del pcGK4232200 de distintos tejidos de carpa. Figura 19 77 Alineamiento de la secuencia aminoacídica para la putativa α-tubulina de carpa con varias especies mamíferas y peces VII INDICE DE TABLAS Tabla N°1: 49 Características de los fragmentos de DNA a subclonar VIII LISTAS DE ABREVIATURAS Amp Ampicilina CG Calicreína glandular dNTP desoxirribonucleótido trifosfato DNAsa Desoxirribonucleasa DO Densidad óptica EDTA ácido etiléndiamino tetracético EtBr bromuro de etidio Kb kilobases (1000 pares de bases) LB medio de cultivo Luria Bertani L Litro MOPS ácido 3-[N-2-morfolino] propano sulfónico nm nanómetro mRNA RNA mensajero pb pares de bases PCR reacción de polimerización de DNA en cadena pfu unidad formadora de placa POPOP p-bis[2-(5-feniloxazolil)]- benceno PPO 2,5-difeniloxazol PRL Prolactina RNA ácido ribonucleico IX S unidad Sverdberg SM solución Murray SMC sitio de múltiple clonamiento SDS dodecil sulfato de sodio SSC citrato de sodio salino SSPE ácido etiléndiamino tetracético de fosfato diácido de sodio salino TAE tampón Tris-acetato; EDTA TCA ácido tricloro acético TE tampón Tris-HCl; EDTA Tris Tris (hidroximetil) aminometano U unidad o unidades V Volt UV ultravioleta 1 1. RESUMEN Calicreína glandular (CG) es una serina-proteasa que al igual que otras proteínas de este tipo tiene una amplia distribución en diferentes tejidos, jugando un rol vital en variados procesos biológicos. CG está presente en todos los mamíferos, donde forma parte de una gran familia génica. Actualmente sólo se conocen las secuencias génicas de diversas CG de mamíferos, no existiendo ningún antecedente al respecto en organismos no mamíferos, como anfibios o peces. A partir del alineamiento de secuencias génicas de CG conocidas, se generó una sonda CG específica de 310pb, se rastrearon alrededor de 500.000 recombinantes de una genoteca de carpa y se obtuvieron 19 clones. El alto número de clones obtenidos sugiere que CG en carpa también forma parte de una gran familia génica. Estos clones presentaron diferentes intensidades de hibridación. Tres de ellos: λcGK423 (moderada), λcGK814 (fuerte) y λcGK1012 (moderada) fueron analizados por Southern blot. Se caracterizó y subclonó un fragmento genómico de 2200pb de λcGK423 (XbaI), en el vector plasmidial pBluescript SK+. El subclon pcGK4232200 se secuenció en su totalidad y analizó comparativamente con los bancos de datos. Este análisis reveló que pcGK4232200 tiene un inserto de 2259pb, que posee un 88% de identidad con el cDNA de α-tubulina de Oncorhynchus keta (salmón chum). Sin embargo, los clones restantes si podrían contener secuencias génicas de calicreína-like presentes en la carpa que permitiran estudiar el sistema calicreína en teleósteos. Análisis por Northern-blot usando como sonda pcGK4232200 con RNA total de diversos órganos de carpa, reveló una intensa expresión en riñón e hígado y más débil intensidad en agallas, músculo e hipófisis. La secuencia del gen putativo de α-tubulina permite estudiar que este gen se comporta como un gen constitutivo durante la aclimatización de carpa. 2 SUMMARY Glandular kallikrein (GK) is a serine-protease that as other proteins of this type has a wide tissue distribution, playing a vital role in varied biological processes. GK is present in the mammals where it forms part of a numerous gene family. CG specific gene sequences are only known from mammals, lacking evidence from no-mammalian organisms, such as amphibios or fishes. From the alignment of existing sequences, a probe of 310pb was generated. Screening of approximately 500.000 recombinants from a carp genomic library resulted in 19 positive clones. The high number of clones obtained suggests that GK in carp may also form part of a gene family.