UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal Laboratório de Toxinologia CAROLINE BARBOSA FARIAS MOURÃO Prospecção de peptídeos neuroativos da peçonha da aranha caranguejeira Acanthoscurria paulensis Brasília 2012 CAROLINE BARBOSA FARIAS MOURÃO Prospecção de peptídeos neuroativos da peçonha da aranha caranguejeira Acanthoscurria paulensis Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília como requisito parcial à obtenção do título de Mestre. Orientadora: Dra. Elisabeth Ferroni Schwartz Brasília 2012 À minha mãe, Jaqueline Barbosa, pelo apoio incondicional. À minha família, meu exemplo e suporte. Ao Lucas Caridade, por todo o carinho. À Dra. Elisabeth Schwartz, que proporcionou a realização deste projeto. À Toxinologia, que por envolver áreas tão diversas e complementares, nos permite enjoar temporariamente de uma enquanto nos divertimos com outra. Agradecimentos Primeiramente à minha querida mãe, pelo amor, suporte, incentivo e por ter sempre apoiado minhas escolhas acadêmicas. A toda minha família, pelo exemplo de união, suporte e por estarem sempre presentes. Ao meu primo Pedro Henrique pela ajuda em campo. Ao Lucas Caridade, pelo amor, companheirismo e motivação. Obrigada por fazer tudo parecer mais simples e por ser tão paciente. À Dra. Elisabeth Schwartz, pela orientação, incentivo, sugestões, e pela confiança depositada em mim. Obrigada pela oportunidade. Ao Dr. Carlos Bloch Jr., do Laboratório de Espectrometria de Massas – EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, por permitir acesso ao laboratório e pelos ensinamentos e sugestões ao longo desses anos. Ao Eder Barbosa, pela amizade e por me auxiliar em todos os sequenciamentos de novo realizados neste trabalho. Ao Dr. Luciano P. Silva pelas conversas e aprendizados. À Dra. Maura Prates pela disponibilidade e ajuda com cromatografias, e aos demais colegas do laboratório. Ao Dr. Frank Marí, do Departamento de Química e Bioquímica da Florida Atlantic University (FAU), EUA, pela oportunidade de aprender um novo ensaio eletrofisiológico e por todo o auxílio, proporcionando um ótimo período de intercâmbio cultural e científico. À sua aluna Mari Heghinian, por me auxiliar diariamente com os ensaios e pelos momentos de diversão, e aos demais integrantes do laboratório. À Lynn Kay e sua família, por me receberem em sua casa e por todo o carinho. Ao Dr. Lourival Possani e à Dra. Rita Restano-Cassulini, do Instituto de Biotecnologia da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), México, pela colaboração e realização de ensaios eletrofisiológicos e sequenciamento N-terminal. Ao Dr. Ernesto Ortiz, pela amizade, pela grande ajuda com a biblioteca de cDNA e por todos os ensinamentos em Biologia Molecular. À Dra. Andréa Maranhão e à Dra. Ildinete Pereira, do Laboratório de Biologia Molecular da UnB, pelas sugestões durante a construção da biblioteca de cDNA. Ao Dr. Marciano Rubini e às alunas Natália Bittencourt e Tatiane Costa, pelo auxílio com as células competentes e eletroforese. Ao Thompson Tomatieli, pela amizade e auxílio técnico. Ao Dr. Paulo Motta, do Laboratório de Aracnídeos da UnB, pelo auxílio da identificação das aranhas. Ao Dr. Antonio Sebben, do Laboratório de Anatomia Comparativa de Vertebrados (LACV) da UnB, pela convivência, empréstimo de materiais e auxílio no ensaio em coração de rã. Ao Dr. Leandro Ambrósio e Pedro Ivo Pellicano pela amizade, conversas e auxílio em campo. Aos professores do Laboratório de Toxinologia (LTx) da UnB. Ao Dr. Carlos Schwartz, pela convivência e pela ajuda em diversas fases do Mestrado, em especial no ensaio em coração de rã. Ao Dr. Osmindo Pires Jr., pelas conversas e pelo auxílio com cromatografias. À Dra. Márcia Mortari pelo auxílio com ensaios farmacológicos e análises estatísticas, e por toda colaboração e sugestões durante o desenvolvimento deste projeto. À Thalita Soares, por ter me ensinado minhas primeiras práticas de laboratório e por me acompanhar nas novas descobertas da Biologia Molecular, pelo auxílio nas saídas de campo e no ensaio inseticida, pelas conversas, momentos de descontração e pela amizade. Ao Jimmy Guerrero Vargas e Fagner Oliveira, pela amizade e auxílio em diversos momentos. Ao Harry Morales e Claudia Jimena pela companhia, auxílio e pela produção de células competentes. Às queridas toxinólogas Pollyanna Campos, Natiela Oliveira, Solange Rego, Janaína Starling, Édelyn Cristina e Carla Vizzotto, pela amizade e colaborações. Ao Rafael Melani, pelo auxílio na extração de peçonha e ensaio em coração de rã. Às meninas da Farmacologia: Lucianna Couto, Lilian dos Anjos, Jacqueline Gonçalves, Priscilla Galante, Cecília Mourão, Flávia Medeiros, Juliana de Castro e Dr. Karla Moreira, pelo auxílio com ensaios farmacológicos e por animarem o ambiente. Aos colegas Christiano Gati, Flávio Dourado e a todos que passaram pelo LTx e que, de alguma forma, permanecem presentes. Aos colegas e alunos da disciplina “Farmacologia de Princípios Ativos de Origem Animal”: Jéssica Macêdo, Andréa Carvalho, Harry Morales, Claudia Jimena, Jacqueline Gonçalves e Priscilla Galante, pelo auxílio com os ensaios de atividade com a peçonha bruta. Ao Washington Oliveira e Valter Cézar, pelo apoio técnico. Ao Luiz Rios, pela incrível ajuda com a coleta de aranhas. A todos os meus amigos, biólogos e não biólogos, que fazem a minha vida mais feliz e que estiveram sempre na torcida. Vocês são essenciais! À CAPES, pela concessão da bolsa. Ao DPP pelo auxílio à pesquisa de campo (Edital 06/2010). À RECOR-IBGE pela autorização para coleta. À Rede Pró-Centro-Oeste Inovatoxin (CNPq), com a qual esta pesquisa esteve vinculada. À Universidade de Brasília e ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, por possibilitarem a execução deste projeto. Resumo Aranhas produzem em sua peçonha uma complexa mistura de moléculas, as quais, devido a seus potenciais neurotóxicos, têm despertado o interesse para a prospecção de novos fármacos e pesticidas. No entanto, poucos estudos são realizados com a peçonha de aranhas caranguejeiras, em especial de espécies encontradas no Brasil. O presente estudo teve como objetivo a caracterização da peçonha bruta da aranha caranguejeira Acanthoscurria paulensis em busca de peptídeos neuroativos, sendo este o primeiro estudo completo realizado com essa peçonha. A peçonha de A. paulensis apresentou um total de 58 frações cromatográficas e 97 massas moleculares distintas, variando de m/z 601,4 a 21.932,3. A dose letal média em camundongos foi de 25,45 ± 2,42 µg/g. Nos ensaios em coração de rã (coração in situ e fatias isoladas de ventrículo), a peçonha bruta e a “fração de baixa massa molecular” (FBMM) promoveram efeitos semelhantes ao do estímulo vagal, os quais foram bloqueados na presença de atropina, um antagonista muscarínico. A fração protéica (FP) da peçonha não apresentou atividade similar nessas preparações. Um peptídeo denominado Ap1a, eluído aos 41% de acetonitrila no fracionamento da peçonha bruta, foi isolado e caracterizado. A sequência precursora da Ap1a apresentou um peptídeo sinal e pró-peptídeo contendo 23 e 27 resíduos de aminoácidos, respectivamente, e 48 resíduos de aminoácidos, com seis cisteínas, referentes ao peptídeo maduro. Esse peptídeo, com massa molecular monoisotópica ([M+H]+) de 5.457,79, apresentou de 60 a 84% de identidade com toxinas da família da HWTX-II. Diferentemente do padrão estrutural proposto para essas toxinas, a Ap1a apresentou um arranjo das pontes dissulfeto típico do motivo ICK. A Ap1a induziu um efeito paralítico dependente da dose em lagartas Spodoptera frugiperda, com DE50 de 13,01 ± 4,21 µg/g. No circuito da Fibra Gigante de Drosophila melanogaster, a Ap1a causou a redução de frequência e amplitude nas respostas das vias GF-TTM e GF-DLM, indicando uma ação na junção neuromuscular de Drosophila, a qual é mediada por receptores glutamatérgicos. A Ap1a foi também letal a camundongos (30 µg/animal via intracranial), causando hipermotilidade com movimentos circulares e saltos e crises tônicas generalizadas com status epilepticus e morte entre 25 e 35 min, sendo esses efeitos semelhantes aos reportados com a administração via i.c.v. de NMDA, um agonista glutamatérgico. A Ap1a (1 µM) não alterou a resposta induzida por acetilcolina na preparação com células de rabdomiossarcoma, e seus efeitos foram mínimos nos canais hNav1.2, hNav1.4, hNav1.5 e hNav1.6. Dessa forma, o presente estudo proporcionou a caracterização química e biológica de uma nova molécula neuroativa da peçonha da aranha A. paulensis, com possível ação na neurotransmissão glutamatérgica, e também a caracterização da peçonha bruta, mostrando uma grande variedade de compostos que podem ser futuramente estudados visando a melhor compreensão de canais iônicos ou receptores celulares e o desenvolvimento de novos fármacos e pesticidas. Abstract Spiders produce in their venoms a complex mixture of molecules which, due to their neurotoxic potential, have raised interest in prospecting new drugs and pesticides. Nevertheless, few studies are carried out with tarantula venoms, especially with species found in Brazil. The present study aimed to characterize the crude venom from Acanthoscurria paulensis tarantula venom in search of neuroactive peptides, being this the first complete study performed with this venom. The venom of A. paulensis presented a total of 58 chromatographic fractions and 97 different molecular masses ranging from m/z 601.4 to 21,932.3. The median lethal dose