THÈSE PRÉSENTÉE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE BORDEAUX ÉCOLE DOCTORALE N° 154 - Sciences de la Vie et de la Santé. SPÉCIALITÉ GENETIQUE Présentée et Soutenue publiquement le 06/04/2021 Par Perrine PENNAMEN Recherche et caractérisation de nouveaux gènes impliqués dans l’albinisme. Directeur de Thèse Professeur Benoit ARVEILER, PharmD., PhD Rapporteurs Mme ROUX, Anne-Françoise, Praticien Hospitalier, Université de Montpellier Mme VIDAUD, Dominique, Maître de Conférence des Universités, Praticien Hospitalier, Université Paris Descartes Jury M. TAIEB, Alain, Professeur Emérite, Université de Bordeaux, Président du jury Mme ODENT Sylvie, Professeure des Universités, Praticien Hospitalier, Université de Rennes 1, Examinateur M. LACOMBE, Didier, Professeur des Université, Praticien Hospitalier, Université de Bordeaux, Invité Titre : Recherche et caractérisation de nouveaux gènes impliqués dans l’albinisme. Résumé : L’albinisme est une affection de la pigmentation caractérisée par l’association d’anomalies oculaires à divers degrés d’hypopigmentation cutanéo-phanérienne et parfois des atteintes systémiques dans les formes syndromiques que sont les syndromes d’Hermansky-Pudlak (HPS) et le syndrome de Chediak-Higashi. Avant ce travail, 19 gènes étaient connus comme impliqués dans des formes isolées ou syndromiques d’albinisme, dont la plupart sont autosomiques récessives à l’exception de l’albinisme oculaire lié à l’X. Après étude complète de ces 19 gènes, environ 25% à 30% des patients restent sans diagnostic moléculaire. Afin de rechercher de nouveaux gènes, nous avons développé et testé un panel de 129 gènes candidats chez 230 patients non résolus sur le plan moléculaire. Ceci a permis de mettre en évidence des variants délétères dans deux nouveaux gènes. Nous rapportons d’une part deux patientes porteuses de variants perte de fonction dans le gène BLOC1S5, une délétion intragénique homozygote emportant les exons 3 et 4 et une délétion homozygote d’une paire de base (pb) de l’exon 4. BLOC1S5 code une des sous-unités du complexe BLOC-1 qui en compte huit et dont 3 sont déjà associées à des formes d’HPS (7, 8, 9). Ces patientes présentent un phénotype d’albinisme modéré et un défaut d’agrégation plaquettaire par déficit en granules denses. Les plaquettes de la patiente 1 présentent une absence de BLOC-1 montrant que la délétion entraine une dysfonction de BLOC1S5 gênant l’assemblage du complexe. Tandis que l’expression du transcrit humain sauvage de BLOC1S5, dans des mélanocytes murins avec KO de Bloc1s5, non pigmentés, restaure la pigmentation, l’assemblage de BLOC-1 et le trafic de cargo, l’expression du transcrit avec la délétion de la 1ère patiente ne le permet pas. Nous avons ainsi démontré que la perte de fonction de BLOC1S5 est responsable d’une nouvelle forme d’HPS, HPS-11. Le deuxième gène, DCT ou TYRP2 est suspecté de longue date du fait de sa collaboration à la synthèse de la mélanine avec TYR et TYRP1, gènes connus d’albinisme (OCA1 et 3, respectivement). Nous décrivons 2 patientes présentant un albinisme cutané modéré avec atteinte ophtalmologique caractéristique et porteuses de variants de DCT. Une patiente est homozygote pour un variant faux sens de l’exon 1 et l’autre hétérozygote composite pour un variant faux sens de l’exon 1 et une délétion de 14pb de l’exon 9. Les deux variants faux-sens sont situés dans des cystéines très conservées et ont été induits chez la souris par CrispR-Cas9, reproduisant l’hypopigmentation modérée et l’atteinte oculaire. Un modèle poisson zèbre a aussi été produit avec atteinte similaire. Nous concluons donc que DCT est impliqué dans une nouvelle forme d’albinisme oculo-cutané, OCA8. Enfin nous rapportons également le phénotype détaillé de trois patients porteurs de nouveaux variants dans BLOC1S3, associé à l’HPS-8, une des formes les plus rares d’albinisme syndromique. Avant ce travail, seulement 2 familles et deux variants étaient décrits dans la littérature. La description détaillée du phénotype de ces patients est une aide aux praticiens dans l’accompagnement diagnostique et pronostique des patients ainsi que pour le conseil génétique. Nous avons donc rapporté deux nouveaux gènes d’albinisme, pour une forme oculocutanée et pour une forme syndromique (HPS), toutes deux apparemment modérées et décrivons de nouveaux variants pour une forme connue mais néanmoins rare d’albinisme syndromique. Mots clés : Maladies génétiques rares, génétique moléculaire, séquençage haut-débit, albinisme, analyses fonctionnelles 1 Title: Search and characterization of new genes involved in albinism. Abstract: Albinism is a pigmentation disorder characterized by visual impairment, isolated (Ocular Albinism, OA) or associated with generalized skin and hair hypopigmentation (Oculo- Cutaneous Albinism, OCA), and sometimes with other symptoms in syndromic forms called Hermansky-Pudlak (HPS) and Chediak-Higashi (CHS) syndromes. Most are autosomal recessive affections except for X-linked OA. Prior to this work 19 genes were known to cause isolated or syndromic albinism. After extensive analysis of these genes, 25 to 30% of patients remain molecularly unsolved. To search for new genes we screened, in 230 patients without molecular diagnosis, a panel of 129 candidate genes. We identified deleterious variants in two candidate genes. First, we report two patients with predicted loss-of-function variants in BLOC1S5 in two patients. The first patient carries an intragenic homozygous deletion involving exons 3 and 4. The second patient has a homozygous one base-pair deletion in exon 4. BLOC1S5 codes for one of the 8 subunits of BLOC-1, three of which are involved HPS-7, 8 and 9. Both patients had mild hypopigmentation, classical ocular albinism and moderate bleeding diathesis, platelet aggregation deficit and a very low number of platelet dense granules, compatible with HPS. Patient 1’s platelets displayed an absence of BLOC-1, showing that the identified mutation disrupts BLOC1S5 function and impairs BLOC-1 assembly. Whereas expression of a wild-type BLOC1S5 protein in non-pigmented murine melanocytes rescued pigmentation, assembly of a functional BLOC-1, and melanosome cargo trafficking, expression of the patient's BLOC1S5 variant allele did not. These data indicate that mutation of BLOC1S5 is disease-causing, and we propose that BLOC1S5 is the gene for a new form of HPS, HPS11. The second gene, DCT or TYRP2 has been suspected for a long time, due to its collaboration with TYR (OCA1) and TYRP1 (OCA3). We describe two unrelated patients presenting with clinical diagnosis of OCA. One patient is homozygous for a missense variant in the exon 1 of DCT and the other is a compound heterozygote for a missense variant in exon 1 and a frame- shift deletion in exon 9. Both missense variants, affecting highly conserved cysteine, were introduced in mice via Crispr-Cas9, which led to mild hypopigmentation of the fur and ocular anomalies. A Zebrafish knock-down model has also been produced by morpholino injection, leading to a significant decrease in melanin levels compared to controls. We propose that DCT is the gene for a new form of OCA, OCA8. In this work we also describe three unrelated patients with novel variants in BLOC1S3 responsible for HPS-8. This rare form of HPS had been reported in only two families and we believe detailed clinical description of patients is useful for clinicians for patient’s diagnosis and prognosis evaluation and genetic counseling. In conclusion we have reported two new genes involved in isolated and syndromic forms of albinism as well as new insight in an already known yet rare form of syndromic albinism. Key Words: Rare genetic diseases, molecular genetics, high throughput sequencing, albinism, functional analyses. Unité de recherche Inserm U1211 - Laboratoire Maladies Rares : Génétique et Métabolisme Ecole de Sages-Femmes - Hôpital Pellegrin Place Amélie Raba-Léon – 33076 BORDEAUX Cedex 2 À Cécile, À Maman, Si tu aimes une fleur qui se trouve dans une étoile, c’est doux, la nuit, de regarder le ciel. Antoine de St Exupéry 3 REMERCIEMENTS Je remercie l’ensemble des membres du jury d’avoir accordé de leur temps précieux pour évaluer ce travail. Je remercie Monsieur le Professeur Alain Taïeb d’avoir accepté la présidence de ce jury. Je souhaite exprimer ma reconnaissance pour votre rôle crucial dans la mise en route du diagnostic moléculaire au CHU de Bordeaux et la mise en place de l’hôpital de jour d’Albinisme qui permet une prise en charge multidisciplinaire hyperspécialisée des patients. Je remercie chaleureusement mes rapporteurs, Mesdames les Docteures Anne-Françoise Roux et Dominique Vidaud, de juger le présent manuscrit et de m’apporter toute leur expertise dans leur évaluation. Madame la Professeure Sylvie Odent, je vous adresse mes plus sincères remerciements pour avoir accepté d’examiner mon travail. Ayant fait mes premiers pas en génétique en tant qu’externe dans votre service, je suis émue de vous montrer une partie du chemin que j’ai parcouru depuis. Je remercie sincèrement Monsieur le Professeur Didier Lacombe de participer à ce jury et vous remercie de m’avoir accueillie avec bienveillance à Bordeaux pour mon post-internat et soutenue dans mes démarches pour y rester au-delà. Je remercie Monsieur le Professeur Benoit Arveiler d’avoir dirigé cette thèse passionnante, d’avoir su me guider avec gentillesse et sagesse dans cette aventure non sans encombre. Je le remercie de m’avoir épaulée dans des moments difficiles, des moments stressants et des moments joyeux également. Je remercie toute l’équipe du Laboratoire Maladies Rares : Génétique et Métabolisme pour leur gentillesse et leur bonne humeur. Je tiens tout particulièrement à souligner l’implication et la contribution précieuse du Docteur Angela Tingaud-Sequeira, sa gentillesse et sa patience pour m’initier à certaines techniques, lors de mon Master 2 puis pour cette thèse. Je remercie également Madame la Professeure Sophie Javerzat qui a rejoint notre équipe au court de ce travail et dont la passion et le dynamisme sont une inspiration.