PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA COORDENAÇÃO DE TECNOLOGIA E INOVAÇÃO LABORATÓRIO DE BIOPROSPECÇÃO E BIOTECNOLOGIA ANÁLISE FITOQUÍMICA SAZONAL E CULTURA DE TECIDOS IN VITRO DE Duroia macrophylla Huber SABRINA SCHUMACKER ZANCA MANAUS, AMAZONAS 2015 INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA COORDENAÇÃO DE TECNOLOGIA E INOVAÇÃO LABORATÓRIO DE BIOPROSPECÇÃO E BIOTECNOLOGIA SABRINA SCHUMACKER ZANCA ANÁLISE FITOQUÍMICA SAZONAL E CULTURA DE TECIDOS IN VITRO DE Duroia macrophylla Huber Orientação: Dra. CECILIA VERONICA NUNEZ Dissertação apresentada ao Programa Integrado de Pós-Graduação em Botânica do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração em Botânica. MANAUS, AMAZONAS Março, 2015. II III IV Ficha catalográfica Biblioteca do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA Z27 Zanca, Sabrina Schumacker Análise fitoquímica sazonal e cultura de tecidos in vitro de Duroia macrophylla Huber / Sabrina Schumacker Zanca. --- Manaus: [s.n.], 2015. xx, 116 f. : il. color. Dissertação (Mestrado) --- INPA, Manaus, 2015. Orientadora : Cecilia Veronica Nunez. Área de concentração : Botânica. 1. Fitoquímica. 2. Duroia macrophylla. 3. Alcaloides. I. Título. CDD 583.52 Sinopse: A variação química dos metabólitos secundários das folhas de dois indivíduos de Duroia macrophylla Huber foi analisada durante 12 meses. Também foi realizado o estabelecimento in vitro de calos a fim de determinar a sua composição química. Ambos foram analisados para verificar a presença de alcaloides e outros metabólitos produzidos pela espécie. Palavras-chave: Duroia macrophylla, fitoquímica, cultura de tecidos in vitro. V Aos meus amados pais Simone e Eliton, às minhas queridas irmãs Susana e Sarah, às minhas avós Erany e Dinorá, e ao meu marido Wagner. A eles agradeço pelo amor, carinho, confiança, força e por tudo que sou. Com amor e gratidão, dedico-lhes este trabalho. VI AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a DEUS por toda força e coragem na hora de enfrentar os desafios. À minha família, em especial aos meus pais Eliton e Simone, pelo apoio, incentivo, paciência, amor e carinho, não somente durante a realização do mestrado, mas em toda a minha vida, até mesmo quando distantes. Às minhas irmãs Sarah e Susana, por fazerem parte da minha vida. Obrigada por serem a minha fortaleza, meu porto seguro! Amo vocês! Ao meu marido, meu amor, Wagner, por sempre estar ao meu lado em todos os momentos, por fazer meu sonho se tornar realidade e compartilhar de tantos outros sonhos para um grande futuro juntos! Te amo! Aos amigos e familiares que se encontram longe, em Santa Catarina, mas estão sempre presentes em meu coração e em minhas lembranças! À minha orientadora Dra. Cecilia Veronica Nunez, pelos ensinamentos, oportunidades, pela confiança no meu trabalho e por toda ajuda durante o mestrado. Ao Dr. Ricardo Serudo, pela colaboração na análise dos dados de componentes principais e pelos conhecimentos compartilhados. Aos meus colegas de laboratório, pela amizade e pelos momentos que passamos juntos! Foram muitos aprendizados, alegrias e tristezas compartilhadas, tornando meus dias, nestes dois anos, muito felizes! Nunca me esquecerei da ajuda e apoio que todos sempre me deram! Aos companheiros da turma 2013/2014 e professores da PPG-Bot do INPA, pela parceria e por compartilharem dos mesmos ideais que eu! Sucesso a todos! Ao CNPq pela concessão da bolsa e apoio financeiro para o projeto. Ao INPA pela infraestrutura e amparo, por ser minha segunda casa, e por possibilitar a realização do meu sonho de ser mestre. A todos que de alguma forma ajudaram e/ou estiveram presentes durante todo o período do mestrado, meu grande obrigado! VII RESUMO ANÁLISE FITOQUÍMICA SAZONAL E CULTURA DE TECIDOS IN VITRO DE Duroia macrophylla Huber A espécie amazônica Duroia macrophylla Huber (Rubiaceae) é produtora de triterpenos e alcaloides com atividades sobre Mycobacterium tuberculosis e um alcaloide com atividade tumoral. Entretanto, coletas realizadas em épocas diferentes mostraram diferença na composição química de diferentes indivíduos. Assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a sazonalidade da produção de metabólitos secundários em extratos de Duroia macrophylla, durante um ano, em dois espécimes. Também foram obtidos calos in vitro da espécie para extrações fitoquímicas e análise da produção dos metabólitos secundários. Para as análises fitoquímicas dos dois indivíduos foram utilizadas folhas coletadas mensalmente de abril/2013 a março/2014. O material vegetal foi submetido à extração com hexano e metanol, em banho de ultrassom. Os extratos foram concentrados e posteriormente analisados por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) e ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H. Os espectros foram comparados por meio de uma análise de componentes principais. As culturas de tecidos in vitro foram estabelecidas com 50% de assepsia, após vários testes, a partir de explantes provindos de folhas jovens e com diferentes tempos de imersão dos reagentes químicos: etanol 70%, hipoclorito de sódio 2% e solução biocida. Depois de estabelecidos, os explantes in vitro foram induzidos ao processo de calogênese através da adição dos reguladores de crescimento cinetina e 2,4-D, em meio Murashige & Skoog. Os calos foram posteriormente extraídos com hexano e metanol e a produção dos metabólitos secundários foi avaliada por análise em CCDC e RMN de 1H. Os extratos hexânicos e extratos metanólicos obtidos dos dois indivíduos de Duroia macrophylla apresentaram indícios da presença de alcaloides e terpenos em todos os meses, durante um ano. A análise de componentes principais demonstrou que há uma variação sazonal na composição química dos extratos hexânicos de folhas de Duroia macrophylla, onde o teor de alcaloides indólicos foi maior na época mais chuvosa. Nos extratos metanólicos das folhas, o mês de novembro apresentou teores significativamente menores de alcaloides indólicos em relação aos outros meses, para os dois indivíduos estudados. Sendo o mês de novembro a época de floração da espécie, pode-se inferir que a planta está redirecionando a sua rota biossintética para a produção de alcaloides indólicos menos polares e também para a produção de outros metabólitos. Os extratos dos calos de D. macrophylla apresentaram terpenos, mas não alcaloides, e não apresentaram atividades antioxidante, tóxica e antibacteriana nos ensaios realizados. Palavras-chave: metabólitos secundários, alcaloides, terpenos, calogênese. VIII ABSTRACT SEASONAL PHYTOCHEMICAL ANALYSIS AND IN VITRO TISSUE CULTURE OF Duroia macrophylla Huber The Amazon species Duroia macrophylla Huber (Rubiaceae) produces triterpenes and alkaloids with activity against Mycobacterium tuberculosis and an indole alkaloid active against tumoral cell lines. Previous studies showed that different plant extracts had difference on the chemical composition. So, the present study aim to assess the seasonal production of secondary metabolites in Duroia macrophylla extracts, in two specimens for one year. Also, callus in vitro were obtained for phytochemical extraction and secondary metabolites production analysis. For the two plants phytochemical analysis, leaves were collected monthly from April/2013 to March/2014. Plant material was grounded and extracted with hexane and methanol, with ultrasound bath. The concentrated extracts were analyzed by thin layer chromatography (TLC) and 1H-nuclear magnetic resonance (1H-NMR). The NMR spectra were compared by principal component analysis (PCA). The in vitro tissue cultures were established from young leaves with 50% of asepsis after several assays and with different immersion times of the chemical reagents: 70% etanol, 2% sodium hypochlorite and biocide solution. In vitro explants were induced to callus formation process by adding the growth regulators kinetin and 2,4- D, on Murashige & Skoog media, and then extracted with hexane and methanol. The production of secondary metabolites was analysed by TLC and 1H-NMR. All hexane and methanol extracts of two Duroia macrophylla individuals showed evidence of the presence of alkaloids and terpenes during a year. The PCA analysis showed seasonal variation on the chemical composition of the hexane extracts of Duroia macrophylla’s leaves, where the production of alkaloids increased during the rainy season. Regarding the methanol extracts of the leaves, the extract from November showed a lower alkaloid content. Being November the flowering species period, we can infer that the plant is redirecting its biosynthetic route for the production of less polar indole alkaloids or other metabolites. D. macrophylla callus extracts showed terpenes but not alkaloids production, and showed no antioxidant, toxic and antibacterial activities in the performed assays. Keywords: secondary metabolites, phytochemical, calogenesis. IX SUMÁRIO LISTA DE TABELAS .................................................................................................XII LISTA DE FIGURAS ................................................................................................XIV LISTA DE ABREVIAÇÕES ......................................................................................XIX 1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................01 2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................04 2.1. Produtos naturais