DOKTORI ÉRTEKEZÉS Majláth Imre 2012 A növények stresszadaptációját kísérő génexpressziós és anyagcsereváltozások tanulmányozása PhD értekezés Készítette: Majláth Imre ELTE Biológia Doktori Iskola (Prof. Dr. Erdei Anna) Kísérletes Növénybiológia Doktori Program (Prof. Dr. Szigeti Zoltán) Témavezet ő: Dr. Szalai Gabriella tudományos tanácsadó MTA ATK Mezőgazdasági Intézet 2012 Tartalomjegyzék 1. Bevezetés............................................................................................................ 1 2. Irodalmi áttekintés.............................................................................................. 2 2.1. Stressz és stresszválasz növényekben ................................................................ 2 2.2. Az alacsony h őmérséklet általános hatásai növényekben ................................... 2 2.3. Az alacsony h őmérséklet elleni védekezés növényekben ................................... 7 2.3.1. ROS semlegesítés – az aszkorbát-glutation ciklus (AGC).................................. 7 2.3.2. Antioxidáns enzimek......................................................................................... 10 2.3.3. Fenolos vegyületek............................................................................................ 12 2.3.4. Növényi hormonok............................................................................................ 12 2.3.4.1. A szalicilsav (SA) hidegstressz elleni védekezésben betöltött szerepe............. 12 2.3.4.2. Az etilén hidegstressz elleni védekezésben betöltött szerepe ........................... 15 2.3.5. A poliaminok (PA) hidegstressz elleni védekezésben betöltött szerepe........... 17 2.3.6. Ozmotikus véd ővegyületek ............................................................................... 18 2.4. A fény biológiai szempontból fontos tulajdonságai.......................................... 18 2.4.1. A fényérzékelés és jelátvitel folyamata............................................................. 19 2.4.2. A fényintenzitás hatása alacsony h őmérsékleten ............................................. 21 2.4.3. A fotoperiódus hatása és az alacsony h őmérséklet kapcsolata ......................... 22 2.4.4. Az árnyékkerülés (Shade Avoidance Syndrome, SAS) és a h őmérséklet kapcsolata .......................................................................................................... 23 2.4.5. Fénystressz (fénygátlás) .................................................................................... 25 2.4.6. A fény károsító hatása elleni védekez ő mechanizmusok.................................. 25 2.5. A stresszfolyamatok vizsgálatának genetikai megközelítései............................ 27 2.5.1. Allélpolimorfizmus ............................................................................................ 27 2.5.2. Szegregációs populációk és a QTL térképezésben való szerepük ..................... 27 2.5.3. A globális génexpressziós vizsgálatok szerepe stressz szignalizáció vizsgálatában ...................................................................................................... 29 3. A kutatások céljai ................................................................................................ 30 4. Anyagok és módszerek........................................................................................ 31 4.1. A növénynevelés körülményei, növényi anyag................................................... 31 4.1.1. Búza..................................................................................................................... 31 4.1.2. Arabidopsis mutánsok és transzgenikus vonalak ................................................ 31 4.1.3. A L er (Cvi) NIL2-8 térképezési populáció .......................................................... 32 4.2. QTL térképezés .................................................................................................... 34 4.2.1. DNS kivonás 96 well plate-en az F2 generációban.............................................. 34 4.2.2. DNS extrakció az F3 generációban...................................................................... 34 4.2.3. Genotipizálás........................................................................................................ 35 4.2.4. Fenotípus-vizsgálat............................................................................................... 36 4.3. Microarray vizsgálat............................................................................................. 36 4.3.1. RNS izolálás és microarray vizsgálat................................................................... 36 4.3.2. Microarray adatfeldolgozás.................................................................................. 37 4.3.3. A szekvenciák reannotációja................................................................................ 37 4.3.4. GO analízis........................................................................................................... 38 4.4. Fagyasztási tesztek .............................................................................................. 38 4.4.1. A fagyasztás körülményei ................................................................................... 38 4.4.2. Bonitálás……………………………………………………………………….. 38 4.4.3. Ionkiáramlás mérés ............................................................................................. 39 4.5. Klorofilltartalom mérés ....................................................................................... 40 4.6. Klorofill-fluoreszcencia indukció mérése ........................................................... 40 4.7. Az aszkorbáttartalom meghatározása.................................................................. 40 4.8. Az antioxidáns enzimek aktivitásának mérése.................................................... 41 4.8.1. Enzimkivonás...................................................................................................... 41 4.8.2. A glutation-reduktáz aktivitásának meghatározása............................................. 41 4.8.3. Az aszkorbát-peroxidáz aktivitásának meghatározása........................................ 42 4.8.4. A mono-dehidroaszkorbát reduktáz aktivitásának meghatározása ..................... 42 4.8.5. A kataláz aktivitásának meghatározása............................................................... 42 4.8.6. A gvajakol-peroxidáz aktivitásának meghatározása ........................................... 42 4.9. A szalicilsav mennyiségének mérése .................................................................. 43 4.10. A poliamintartalom meghatározása..................................................................... 44 4.11. Az ACC- és MACC-tartalom meghatározása ..................................................... 45 4.12. Az összfenol-tartalom mérése ............................................................................. 46 4.13. A prolintartalom meghatározása ......................................................................... 47 4.14. Statisztikai elemzések ......................................................................................... 47 5. Eredmények......................................................................................................... 49 5.1. A fény szerepe a búza hidegedzése alatt ............................................................. 49 5.1.1. A transzkripciós mintázat eltérései a fajták között eltér ő fényintenzitás hatására…………. ............................................................................................... 49 5.1.2. A stresszhez köt ődő anyagcseretermékek változásai a hidegedzés hatására a megvilágítás függvényében................................................................................. 54 5.1.2.1. Ozmoprotektánsok: prolin.............................................................................. 54 5.1.2.2. Antioxidáns vegyületek: összfenol-tartalom.................................................. 55 5.2. A hideg- és fagyt űrés élettani vizsgálata eltér ő fagyt űrés ű Arabidopsis mutánsokban és transzgenikus vonalakban.................................................... 56 5.2.1. Fagyasztási tesztek ......................................................................................... 57 5.2.2. A fotoszintetikus apparátus szerepe ............................................................... 58 5.2.2.1. A klorofilltartalom változásai......................................................................... 58 5.2.2.2. A PSII kvantumhasznosítási paraméterei (Fv/Fm és ∆F/Fm’)....................... 60 5.2.2.3. A fotoszintézishez köt ődő paraméterek változásainak egymással való kapcsolata ............................................................................................... 63 5.2.3. Az antioxidáns védekez őrendszer aktivitása – az aszkorbát-glutation ciklus vizsgálata ............................................................................................. 64 5.2.3.1. Glutation-reduktáz.......................................................................................... 64 5.2.3.2. Mono-dehidroaszkorbát reduktáz (MDHAR) ................................................ 65 5.2.3.3. Aszkorbát-peroxidáz ...................................................................................... 65 5.2.3.4. Az aszkorbátszint (AA) változásai................................................................. 66 5.2.4. A szalicilsavszint (SA) változásai.................................................................. 68 5.2.4.1. Az orto-hidroxi fahéjsav