UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAUDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ABORDAGEM FITOQUÍMICA, DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPLASMÓDICA IN VITRO E AVALIAÇÃO PRELIMINAR DA TOXICIDADE DO EXTRATO HIDROETANÓLICO DAS CASCAS DE Aspidosperma excelsum Benth (APOCYNACEAE) Luis Fábio dos Santos Gomes BELÉM - PA 2011 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAUDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ABORDAGEM FITOQUÍMICA, DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPLASMÓDICA IN VITRO E AVALIAÇÃO PRELIMINAR DA TOXICIDADE DO EXTRATO HIDROETANÓLICO DAS CASCAS DE Aspidosperma excelsum Benth (APOCYNACEAE) Autor: Luis Fábio dos Santos Gomes Orientador: Prof. Dr. Flávio de Vasconcelos Co-Orientadora: Profa. Dra. Maria Fani Dolabela Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Pará para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas Área de concentração: Fármacos e Medicamentos BELÉM - PA 2011 III Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) Biblioteca do Instituto de Ciências da Saúde – UFPA Gomes, Luís Fábio dos Santos. Abordagem Fitoquímica, determinação da atividade antiplasmódica in vitro e avaliação preliminar da toxicidade do extrato hidroetanólico das cascas de Aspidosperma excelsum Benth (apocynaceae) / Luís Fábio dos Santos Gomes ; orientador, Flábio de Vasconcelos, co-orientador, Maria Fani Dolabella. — 2011 Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências da Saúde, Faculdade Farmácia, Belém, 2011. 1. Aspidosperma execelsum Benth. 2. Caranaúba. 3. Apocynaceae. 4. Malária. 5. Atividade Antiplasmódica. 6. Alcalóides. 7. Toxicidade. I. Título. CDD 22.ed. : 615.321 IV FOLHA DE APROVAÇÃO Luis Fábio dos Santos Gomes “Abordagem fitoquímica, determinação da atividade antiplasmódica in vitro e avaliação preliminar da toxicidade do extrato hidroetanólico das cascas de Aspidosperma excelsum Benth (Apocynaceae) ” Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Pará para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas Área de concentração: Fármacos e Medicamentos Aprovado em: ____/____/_______ BANCA EXAMINADORA Prof. Dr.: Flávio de Vasconcelos Instituição: Universidade Federal do Pará Assinatura:_____________________________________ Prof. Dr.: José Luiz Fernandes Vieira Instituição: Assinatura:_____________________________________ Prof. Dr.: Valdir Florêncio da Veiga Júnior Instituição: Universidade Federal do Amazonas Assinatura;_____________________________________ V Dedico aos meus pais, Luís Antônio Bandeira e Maria José. A dedicação incondicional de vocês na minha educação foi fundamental, ter chegado até aqui não foi fácil, mas conseguimos. Dedico a minha avó (Daiza) em memória e ao meu pai de criação (Joaquim) os anos que passamos juntos foi essencial na minha vida. A minha esposa Keylla, obrigado pela paciência e dedicação como mulher, amiga e mãe, você fez a diferença na minha vida. Dedico especialmente a minha filha Anna Luisy, minha vida teve um novo sentido depois da sua chegada, você é maior incentivo pra tudo isso, papai te ama. Luís Fábio dos Santos Gomes VI AGRADECIMENTOS Obrigado Deus Todo-Poderoso pelo dom da vida e da sabedoria. Obrigado por permitir que nos mortais por meio da ciência, possamos desvendar os mistérios da natureza que o Senhor criou. Meus pais, Luís Antônio Bandeira e Maria José, as dificuldades que passamos mais uma vez foram vencidas. A minha avó (Daiza) em memória, pela dedicação de anos na minha criação, anos esses que lembro com muita nostalgia, mas que não voltam mais. E ao meu pai de criação (Joaquim) pela sua imensa dedicação também na minha educação. A minha irmã (Flávia) e a meu irmãozinho (Marco Aurélio) e minhas sobrinhas Maria Beatriz e Bianca. A todos os momentos de alegria compartilhados durante todos esses anos. Minha esposa (Keylla), só tenho que agradecer enormemente por todos esses anos de dedicação ao meu lado, e por ser a mãe da jóia mais preciosa que Deus nos concedeu, nossa filha Anna Luisy. Agradeço aos contribuintes desse imenso país. Aqueles que levantam cedo todos os dias para ir trabalhar, a todos os Josés e a todas as Marias, foi por causa de vocês que consegui fazer a minha graduação e meu mestrado em uma universidade pública. Ao meu orientador, Prof. Dr. Flávio de Vasconcelos, pela sua dedicação em me orientar, pelos ensinamentos. Fico muito feliz em ser o seu primeiro orientando de pós-graduação, é algo que nunca esquecerei. A Dra. Marinete Póvoa do Laboratório de Malária do Instituto Evandro Chagas, pela autorização na utilização do Laboratório para o cultivo das cepas de P. falciparum. Ao Instituto Evandro Chagas pela doação dos animais utilizados neste trabalho. Ao Prof. Wagner Barbosa que fez parte desse projeto. Agradeço pelas orientações e pelos resultados obtidos no Laboratório de Fitoquímica da Faculdade de Farmácia da UFPA. Ao Prof. Dr. Washington Luiz Assunção Pereira, pela sua contribuição na análise histopatológica. Ao Prof. Dr. José Luiz Vieira, pela contribuição científica neste trabalho e pela amizade. A Universidade Federal do Pará, que foi meu segundo lar nestes últimos oito anos. VII Aos amigos do Laboratório de Toxicologia da Faculdade de Farmácia, Priscilla e Amanda pelos momentos de alegria no laboratório. Ao Thiago Vilhena, Thiago Leite e Caroline pelo enorme ajuda no experimento de toxicidade aguda. A amiga de mestrado Eliane Moraes, por ter realizado os experimentos de citotoxicidade no Laboratório de Fotoquimioproteção e Controle da Qualidade da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP de Ribeirão Preto. Um agradecimento muito especial a Eliane que foi mais do quê uma colega de mestrado. Aos meus amigos do mestrado. Bruno (futuro papai), Andressa Santa Brígida (mana), Heitor (do Bongô), Anivaldo Júnior, Eliane, Taís Gabbay, Josy, Cléia, Alex Oselu, Sarah Scarlécio, Taysa (Tica), Jeane. Um imenso agradecimento a todos vocês por todos os momentos de alegrias que passamos juntos, a amizade de vocês foi fator essencial nesse mestrado que foi apenas dois anos, mas a amizade será para sempre. A Coordenação do Programa de Pós-Gradduação em Ciências Farmacêuticas. Ao Prof. Dr. José Otávio Carrerá coordenador do PPGCF pelos conselhos e pela amizade. A Cliciane secretária do PPGCF, sempre disposta ao trabalho e resolvendo os problemas, e também a dona Brasília, vou sentir falta daqueles cafés dela que reunia toda a turma naqueles fins de tarde. Aos amigos do mestrado da turma de 2010. Michel (Restart), Dayse, Thaís Andrade, Ademar Melo e Fabrício Alexopulos amigo desde os bons tempos de graduação. VIII “Quanto mais me elevo, menor fico aos olhos de quem não sabe voar.” (Friedrich Wilhelm Nietzsche) IX RESUMO GOMES, L.F.S. “Abordagem fitoquímica, determinação da atividade antiplasmódica in vitro e avaliação preliminar da toxicidade do extrato hidroetanólico das cascas de Aspidosperma excelsum Benth (Apocynaceae)”. 2011. 98 p. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Pará. A malária é uma doença causada por protozoários do gênero Plasmodium. O tratamento da malária está se tornando cada vez mais difícil com a expansão dos casos de parasitas resistentes aos fármacos utilizados na terapêutica. Neste contexto, produtos isolados a partir de plantas têm dado importante contribuição, representando importante fonte para a obtenção de novos fármacos antimaláricos. A atividade antiplasmódica de alcalóides de origem vegetal tem sido amplamente relatada na literatura. Plantas da família Apocynaceae, ricas em alcalóides indólicos, apresentam amplas propriedades medicinais e algumas espécies do gênero Aspidosperma já demonstraram potencial antimalárico. Assim, este trabalho teve como objetivo realizar uma abordagem fitoquímica, avaliar a atividade antiplasmódica in vitro e a toxicidade preliminar do extrato hidroetanólico concentrado das cascas de A. excelsum, nativa da Região Amazônica, onde é usada tradicionalmente para tratar várias enfermidades, inclusive malária. A atividade antiplasmódica in vitro de diferentes concentrações do extrato e frações alcaloídica e metanólica foi avaliada em culturas de P. falciparum W2 pela percentagem de inibição da parasitemia e determinação da concentração inibitória média (CI50) em intervalos de 24, 48 e 72 h. O ensaio de citotoxicidade do extrato e fração alcaloídica foi realizado em fibroblastos L929 de camundongo pelo método do MTT e o teste de toxicidade aguda oral do extrato foi realizado de acordo com o Procedimento de Dose Fixa adotado pela OECD com pequenas adaptações. A prospecção fitoquímica revelou a presença de saponinas, açúcares redutores, fenóis e taninos e alcalóides e estes foram confirmados em quantidades significativas na fração alcaloídica extraída com clorofórmio (C2). Através de cromatografia em camada delgada e cromatografia líquida de alta eficiência do extrato, foi caracterizada a presença do alcalóide indólico ioimbina. O extrato e as frações apresentaram atividade antiplasmódica in vitro. O extrato apresentou a melhor atividade em 24 h (CI50= 5,2 ± 4,1 µg/mL), indicando uma boa atividade esquizonticida. Apenas a fração alcaloídica C2 apresentou uma pequena, porém significativa citotoxicidade (concentrações superiores a 800 µg/mL). O extrato não só não apresentou citotoxicidade como também nenhum sinal evidente de toxicidade aguda oral na dose de 5000 mg/mL. Os resultados obtidos indicam que