Universidad Central “Martha Abreu” de Las Villas. Facultad de Química-Farmacia. Departamento de Farmacia. Trabajo de Diploma Identificación “in silico” y corroboración “in vitro” de nuevos compuestos con actividad analgésica. Autora: Oremia del Toro Cortés Tutores: Dr.: Yovany Marrero Ponce Dr. Gerardo Casañola Martín Msc. Arelys López Sacerio Asesor: Dr. Juan Alberto Castillo Garit Santa Clara. 2009. ________________________________________________________________________ La sabiduría es vida para quien la obtiene; ¡dichoso los que saben retenerla! Proverbio 3.18 ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ Dedicatoria A mis padres por traerme al mundo y luego enseñarme a vivir, a mi tía por mostrarme el camino con su infinito amor y al resto de mi familia, especialmente a mis abuelos. A mi esposo por no faltar a su promesa de amarme en las buenas y en las malas y por brindarme su apoyo incondicional cada día de mi vida. ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ Agradecimientos Es una satisfacción para mí expresar mis más sinceros agradecimientos a todas aquellas personas de una manera u otra me han ayudado a culminar exitosamente mis estudios y este trabajo. Quisiera agradecer especialmente a mi familia y a mi esposo por confiar en mí y por todo el apoyo y el amor que me han brindado durante todo el transcurso de mi carrera. A mis tutores Arelys y Gerardo por su apoyo, ánimo y dirección durante el desarrollo de este trabajo. Al Grupo de Diseño de Fármacos, especialmente a Juan Alberto por su atención y toda la ayuda que me ha brindado para el desarrollo de esta tesis. A mis compañeros de aula especialmente a Leyanis, Zuleidys Yunier y Yamilka por estar conmigo en los momentos buenos y malos durante estos cinco años de mi vida estudiantil. A todos muchas gracias. ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ Resumen En este trabajo el objetivo fundamental es identificar “in silico” nuevos candidatos analgésicos a través del programa TOMOCOMD-CARDD y posterior corroboración “in vitro”.Con este propósito primeramente se recolecta una base de datos de la literatura de compuestos a los que se le ha reportado experimentalmente actividad analgésica para acceder al análisis y modelación confiable de la data. A través del método de selección de variables se identifican los descriptores que permiten la separación de la data en dos clases (analgésicos y no analgésicos). Empleando índices lineales estocásticos y no estocásticos basados en relaciones de enlace se obtienen modelos QSAR-ADL. Luego se seleccionó uno de los modelos obtenidos para demostrar el cumplimiento de los cinco principios de la Organización Europea para la Cooperación y el Desarrollo (OECD) .En este sentido, se realiza un proceso de validación interna utilizando los métodos de Validación Cruzada (VC) y Y-Aleatoria. Además se desarrolla un estudio del Dominio de Aplicación. Se aplicaron los modelos obtenidos al tamizaje virtual mediante el cual se identificaron varios fármacos utilizados en la terapéutica actual con otros usos farmacológicos y compuestos sintetizados por diferentes laboratorios como posibles analgésicos. Finalmente se evaluaron 19 compuestos de síntesis mediante técnicas electrofisiológicas y se identificaron 2 de ellos con ligera actividad agonista opioide mu. De forma general podemos concluir que el método TOMOCOMD-CARDD y el desarrollo de los modelos QSAR-ADL propuestos en este trabajo resultan una herramienta para la identificación de nuevos compuestos líderes con actividad analgésica. ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ Glosario λ Lambda de Wilks ΔP% Porcentaje de Clasificación 5-HT Serotonina AINEs Antiinflamatorios no esteroides ADL Análisis Discrimintante Lineal ADME Absorción, Distribución, Metabolismo y Excreción ADT Antidepresivos Tricíclicos ARN Acido Ribonucleíco AC Análisis de Cluster COX Ciclooxigenasa CV Cribado Virtual CARDD Computed-Aided ‘Rational’ Drug Design D2 Distancia de Mahalanobis DMs Descriptores Moleculares Ec. Ecuación F Fisher FC Función de Clasificación FD Función Discriminante GIRK1 y 2 Canales de Potasio IL-6 Interleuquina 6 k-MCA Análisis de cluster de k-medias NA Noradrenalina OMS Organización Mundial de la Salud OFQ Orfalina FQ OECD Organización Europea para la Cooperación y el Desarrollo PGs Prostaglandinas PAG Periacueducto gris QSAR Quantitative Structure Activity Relationship SE Serie de Entrenamiento SP Serie de Predicción ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ SNC Sistema Nerviosa Central SG Sustancia gris TOMOCOMD TOpological MOlecular COMputer Design VC Validación Cruzada ________________________________________________________________________ Pág. RESUMEN GLOSARIO INTRODUCCIÓN 1 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.1 Dolor. 5 1.2 Tipos de Dolor. 6 1.3 Fisiología del Dolor. 7 1.3. 1 Mediadores químicos. 11 1. 4 Sistema Opioide. 14 1. 4. 1 Péptidos Endógenos. 14 1.4.2 Receptores Opioides. 15 1.5 Fármacos Analgésicos 21 1.5.1 Analgésicos opiáceos. 21 1.5.1.1 Mecanismo de acción 23 1.5.1.2 Propiedades Farmacológicas. 24 1.5.1.3 Reacciones Adversas. 25 1.5.1.4 Relación Estructura Actividad 26 1. 5.2 Antiinflamatorios no esteroideos. 31 1. 5.3 Otros fármacos analgésicos. 32 1.6 Evaluación de la actividad analgésica. 34 1.6.1. Técnicas “in vitro”. 34 1.7 Método computacional y análisis quimiométrico de los datos. 35 1.7.1 Método Computacional 36 ________________________________________________________________________ 1.7.1.1 Descriptores TOMOCOMD-CARDD basados en relaciones entre 37 enlaces químicos. 37 1.7.1.2 “Background” sobre la matriz de adyacencia entre enlaces del grafo molecular y nuevas relaciones de enlaces: Matriz estocástica de adyacencia entre enlaces químicos 39 1.7.1.3 Definición de los índices cuadráticos, bilineales y lineales basados en relaciones de enlaces químicos 1.8 Análisis Quimiométrico de los datos 40 1.8.1 Métodos de Clasificación 41 1.8.2 Análisis Discriminante Lineal (ADL) para la Predicción de la Actividad. 42 1.8.3 Estimación de los Coeficientes. 43 1.8.4 Matriz de Clasificación. 43 1.8.5 Significación de la Función Discriminante (FD). 43 1.8.6 Criterios de Selección de Variables. 44 1.8.7 Selección del Número Óptimo de Predictores. Principio de la Parsimonia. 45 1.8.8 Análisis de Conglomerados (CA, de sus siglas en inglés, Cluster 45 Analysis) 1.8.9 Validación Estadística de los Modelos QSAR. 46 1.9 Regulaciones de los Métodos QSAR 47 1.10 Métodos de Cribado Virtual Basados en Ligandos 49 MATERIALES Y METODOS 2.1. Ensayos in silico 53 2.1.1 Generalidades 53 2.1.2 Base de datos de los compuestos usados en la obtención de los modelos 53 ADL-QSAR (Análisis Discriminante Lineal - Quantitative Structure Activity Relationship). 2.2 Cálculo de los nuevos descriptores moleculares. TOMOCOMD-CARDD 56 Software. ________________________________________________________________________ 2.3. Análisis Estadístico de los Datos: Desarrollo de las Funciones 59 Discriminantes (FDs) usando ADL. 2.4 Identificación/Selección “in silico” de compuestos con actividad 61 analgésica. 2.5 Evaluación “in vitro” de la actividad analgésica en receptores opioides mu 61 (μ). 2.5.1 Subclonaje y Transcripción “in vitro” de cDNA, clonaje de Canales 61 GIRK1/2; Receptores Humanos μ-Opioides (hMOR) y RGS4. 2.5.2 Técnica Electrofisiológica “ in vitro ” 62 RESULTADOS Y DISCUSION 3.1. Generalidades 63 3.2Obtención de las series de entrenamiento y predicción. 63 3.3 Desarrollo de Modelos QSAR-ADL 66 3.4 Identificación de Nuevas Entidades Moleculares como Analgésicos 74 utilizando los Modelos in silico: El “Screening” Virtual como una Promisoria Alternativa para la Selección y el Diseño Racional de Fármacos Analgésicos. 3.5 Estudios “in vitro” de la actividad analgésica. 75 CONCLUSIONES 78 RECOMENDACIONES 79 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 80 ________________________________________________________________________ INTRODUCCION. El dolor es un síntoma que ha estado ligado al hombre desde el surgimiento de la humanidad y acompaña al mismo durante todo el trayecto de su vida ya que ¿Quién no ha experimentado alguna vez la sensación dolorosa? El dolor se define como una experiencia sensorial desagradable que se asocia con una lesión tisular o que se describe como si esta hubiera ocurrido(1) Nos encontramos dentro de los 50 millones de americanos que sufren dolor persistente, entre las 25 millones de personas que experimentan dolores agudos a consecuencia de una herida o cirugía, o dentro del 1 millón de individuos diagnosticados con cáncer cada año(2). El dolor es la causa más frecuente de consulta medica al tener alta prevalencia y un gran impacto social por sus repercusiones en el ámbito familiar, laboral y social debido a que impide el desarrollo de las actividades cotidianas con normalidad, además de que presenta un costo económico muy elevado(3). En la actualidad el dolor esta estrechamente vinculado a patologías de alta incidencia a nivel mundial como son el cáncer, enfermedades osteomusculares, neuropatías, infarto del miocardio entre otras, un ejemplo de ello es que el dolor agudo asociado al cáncer es la primera causa