UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL CENTRO DE BIOTECNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR PADRÃO HORMONAL DURANTE A DORMÊNCIA DE GEMAS DE MACIEIRA Dissertação de Mestrado Julio de Andrade Garighan Porto Alegre, Dezembro de 2017 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL CENTRO DE BIOTECNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR PADRÃO HORMONAL DURANTE A DORMÊNCIA DE GEMAS DE MACIEIRA Julio de Andrade Garighan Dissertação submetida ao programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular do Centro de Biotecnologia da UFRGS como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre Orientador: Prof. Dr. Giancarlo Pasquali Coorientadores: Dr. Luís Fernando Revers Dr. Henrique Pessoa dos Santos Porto Alegre, Dezembro de 2017 2 Este trabalho foi desenvolvido nos Laboratórios de Genética Molecular Vegetal e de Fisiologia Vegetal da Embrapa Uva e Vinho, Bento Gonçalves, RS. Recebeu auxílio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), da Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) e da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa). 3 Agradecimentos A Deus, pela oportunidade de vida. Em especial à minha família: meus pais Beatriz e Carlos, que sempre incentivaram meus estudos, fornecendo as condições necessárias para eu alcançar meus objetivos; e minhas irmãs Gabriella, Bibiana e ao Ygor, que apesar da distância sempre me motivaram a seguir em frente e não desistir dos meus sonhos Ao Dr. Henrique Pessoa dos Santos, responsável pelo Laboratório de Fisiologia Vegetal da Embrapa Uva e Vinho, por sua orientação, ensino e entusiasmo ao longo deste mestrado, principalmente pelo confiança em mim depositada e pelos conhecimentos compartilhados. As produtivas discussões sempre agregaram conhecimento e ajudaram a manter o foco durante a execução desse trabalho. Ao Dr. Luís Fernando Revers, responsável pelo Laboratório de Genética Molecular Vegetal da Embrapa Uva e Vinho, por sua coorientação, apoio e confiança em mim depositada, além dos conhecimentos compartilhados. Ao meu terceiro orientador, Prof. Dr. Giancarlo Pasquali, por sua coorientação, confiança em meu potencial e entusiasmo com o projeto. À Universidade Federal do Rio Grande do Sul, pela oportunidade de estudo em uma universidade pública e de qualidade. À Embrapa Uva e Vinho, por permitir acesso à sua estrutura e fornecer os recursos necessários para a realização desse trabalho. À CAPES, pela concessão da bolsa de Mestrado. Aos colegas do Laboratório de Fisiologia Vegetal, Daniel, Aline, Tiago, Vagner e Suelen, pelo apoio, conversas, amizade e carinho. Aos colegas do Laboratório de Genética Molecular Vegetal, Caru, Rafael, Vanessa, Jaiana, Yohanna, Patrícia, Amanda, Tiago, Lariane, Danieli e Roberta, pela amizade e carinho. Aos meus queridos amigos Bianca, Gabriela, Jackson, Tais, Mariana, Thais, Raissa e Patrícia por acompanharem toda essa aventura desde a graduação, vocês foram essenciais. Ao PPGBCM e ao CBiot, pela qualidade de ensino, especialmente à minha Comissão de Acompanhamento, Márcia Márgis-Pinheiro e Arthur Fett, pela atenção despendida durante estes anos, e a Sílvia e ao Luciano, pela agilidade e prontidão. Aos Professores da Banca Examinadora, pela disponibilidade, pelas críticas e sugestões. 4 Sumário LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES ................................. 6 RESUMO............................................................................................................ 8 ABSTRACT ........................................................................................................ 9 1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 10 1.1 DORMÊNCIA .......................................................................................... 10 1.2 REGULAÇÃO HORMONAL NA DORMÊNCIA ....................................... 12 1.3 MÉTODO DE ANÁLISE DE HORMÔNIOS ............................................. 13 1.3.1 EXTRAÇÃO HORMONAL ................................................................ 15 1.3.2 QUANTIFICAÇÃO HORMONAL ....................................................... 16 1.4 EFEITO MATRIZ E ESTRATÉGIAS DE CONTROLE ............................. 17 1.4.1 PURIFICAÇÃO HORMONAL ............................................................ 18 1.5 CULTURA DA MACIEIRA ....................................................................... 22 2 OBJETIVOS .................................................................................................. 25 2.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................. 25 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................... 25 3 CAPÍTULO I .................................................................................................. 26 A protocol for hormone extraction and quantification from complex lignified plant bud tissues. .......................................................................................... 26 4 CAPÍTULO II ................................................................................................. 70 Hormonal Quantification in Dormant Buds of Apple Trees under the Influence of Different Rootstocks .................................................................................. 70 5 DISCUSSÃO ................................................................................................. 96 5.1 MÉTODO PARA EXTRAÇÃO, PURIFICAÇÃO E DETECÇÃO/QUANTIFICAÇÃO DE HORMÔNIOS EM GEMAS DORMENTES. .............................................................................................. 96 5.2 BALANÇO HORMONAL DE GEMAS DORMENTES DE MACIEIRA SOB INFLUÊNCIA DE DIFERENTES PORTA-ENXERTOS ............................... 100 6 PERSPECTIVAS ......................................................................................... 106 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 107 CURRICULUM VITÆ resumido .................................................................... 112 APÊNDICE ..................................................................................................... 116 5 LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES ABA - ácido abscísico, do inglês, abscisic acid APCI – ionização química à pressão atmosférica, do inglês Atmospheric Pressure Chemical Ionization ARR-tipo B - domínio de ligação ao DNA, associado a respostas a citocinina, do inglês Arabidopsis thaliana Response Regulator BB – brotação da gema apical acima de 50%, do inglês Bud Break Castel – cultivar Castel Gala de macieira CH – hora(s) de resfriamento, do inglês, Chilling Hour(s), período(s) sob temperaturas abaixo ou igual a 7,2°C CKs – citocininas, do inglês cytokinin CL – cromatografia líquida CR – requerimento de frio, do inglês, Cold Requirement cv. - cultivar DAM – gene MADS-BOX associados a dormência, do inglês DORMANCY- ASSOCIATED MADS-BOX (DAM) genes DNA - ácido desoxirribonucleico, do inglês Deoxyribonucleic Acid ESI – ionização por eletropulverização, do inglês, Eletrospray Ionization FAO – Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura, do inglês Food and Agriculture Organization g - gravidade GA - ácido giberélico, do inglês, gibberelic acid Gala – cultivar Gala Standard de macieira GA3 - ácido giberélico 3, do inglês, gibberellic acid 3 GA4 - ácido giberélico 4, do inglês, gibberellic acid 4 GH17 - 1,3-β-glicanases 17 há - hectare IAA – ácido indol-3-acético, do inglês, indolacetic acid JA – ácido jasmônico, do inglês, jasmonic acid LLE – extração líquido-líquido ou em fase líquida, do inglês, Liquid Phase Extraction MADS box – motivo de ligação ao DNA, do acrônimo em inglês de MCM1 AGAMOUS DEFICIENS SRF MaM9 – Porta-enxerto Marubakaido com interenxerto de M9 de 10 cm Maruba – Porta-enxerto Marubakaido (Malus prunifolia) M9 – Porta-enxerto East Malling 9 (Malus pumilla) ME – efeito matriz, do inglês, Matrix Effect MRM - monitoramento de reações múltiplas, do inglês multiple-reaction monitoring MS – espectrometria de massas, do inglês, Mass Spectrometry m/z – medida de ionização da massa por carga 6 Neg – modo de ionização negativa no cone, localizado entre a ionização e os espectrômetros de massa pH – potencial de hidrogênio, do inglês Potential of Hydrogen pKa - constante de dissociação ácida Pos – modo de ionização positiva no cone, localizado entre a ionização e os espectrômetros de massa PVPP – polivinilpolipirrolidona QuEChERS - técnica de análise desenvolvida originalmente para resíduos de pesticidas, nomeada de acordo com o acrônimo em inglês de Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe RNA - ácido ribonucleico, do inglês Ribonucleic Acid RT-qPCR – reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real, do inglês Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction SA – ácido salicílico, do inglês, salicylic acid SLV – guia de regras de validação de métodos, do inglês Guidelines for Single Laboratory Validation S/N – razão sinal/ruído, do inglês Signal/Noise SPE – extração em fase sólida, do inglês, Solid Phase Extraction ton - tonelada UPLC – cromatografia líquida de ultradesempenho, do inglês, Ultra- Performance Liquid Chromatography UPLC-MS/MS – aparelho de UPLC acoplado diretamente a um aparelho de espectrometria de massas em tandem v/v – volume por volume V - volume Z – zeatina 7 RESUMO A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de grande importância econômica que apresenta dormência invernal. Sua produtividade depende da superação da dormência, a qual