Tesis Doctoral E2, regulador de transcripción y replicación del papilomavirus humano: interacción con ADN, dinámica conformacional y divergencia evolutiva Dellarole, Mariano 2010 Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente. This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source. Cita tipo APA: Dellarole, Mariano. (2010). E2, regulador de transcripción y replicación del papilomavirus humano: interacción con ADN, dinámica conformacional y divergencia evolutiva. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Cita tipo Chicago: Dellarole, Mariano. "E2, regulador de transcripción y replicación del papilomavirus humano: interacción con ADN, dinámica conformacional y divergencia evolutiva". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2010. Dirección: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Contacto: [email protected] Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293 UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES DEPARTAMENTO DE QUIMICA BIOLOGICA “E2, regulador de transcripción y replicación del papilomavirus humano: interacción con ADN, dinámica conformacional y divergencia evolutiva” Lic. Mariano Dellarole Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área Química Biológica. Director de Tesis: Dr. Gonzalo de Prat Gay Consejero de Estudios: Dr. Eduardo Tomás Cánepa Lugar de trabajo: Laboratorio de Estructura-Función e Ingeniería de Proteínas, Fundación Instituto Leloir e Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, Patricias Argentinas 435, Buenos Aires, Argentina. Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina, seis de Diciembre de 2010 2 Resumen “E2, regulador de transcripción y replicación del papilomavirus humano: interacción con ADN, dinámica conformacional y divergencia evolutiva” Más de 50 tipos de papilomavirus humanos (HPV) infectan epitelio mucoso causando una variedad de lesiones benignas y malignas. El dominio C-terminal de la proteína E2 de HPV (E2C) discrimina entre cuatro sitios de ADN altamente similares regulando el ciclo de vida del virus vía la activación de la replicación y la activación y/o represión de la transcripción. Con el fin de tratar de entender la naturaleza de la interacción entre E2C y ADN, realizamos un análisis detallado del complejo utilizando herramientas bioinformáticas y el contenido de información en las secuencias proteicas y nucleotídicas y usando técnicas biofísicas, proteínas E2C recombinantes y sitios sintéticos de ADN específicos y no-específicos. Antes de estudiar el rol de la interacción E2C-ADN, nos focalizamos en el proceso de polimerización no-funcional de E2C dado que su desarrollo es reprimido por la presencia de ADN específico. Inducida por temperatura, la polimerización de E2C se desencadena mediante la formación de un núcleo estructurado y finaliza en un paisaje morfológico de oligómeros solubles con propiedades amiloideas. El estudio computacional de la interacción E2-ADN de todos los tipos de HPV mucosos indica que las proteínas E2 de distintos tipos poseen propiedades de discriminación de ADN similares. Las diferencias en la interacción E2-ADN se encuentran principalmente en la secuencia de ADN específico, en acuerdo con el análisis de la unión de E2C a diferentes sitios mediante titulaciones isotérmicas de calorimetría. Basado solamente en la secuencia de ADN, logramos predecir diferencias en la energía de unión las cuales se ordenaron en seis grupos de afinidades discretas. Ciertas jerarquías de afinidades como también distancias entre sitios y presencia de sitios de metilación se encontraron estadísticamente asociados con tipos de HPV propensos a ser malignos. Estudiamos la estabilidad y la propiedad de discriminación de secuencia de cinco proteínas E2C homólogas de identidad de secuencia proteica en el rango 44% al 77%. La desnaturalización al equilibrio y la cinética de desplegado en cloruro de guanidinio mostró que todos los dominios son homodímeros estables que se desnaturalizan vía un mecanismo de dos estados. Medimos la unión a distintos sitios de ADN y confirmamos que el mecanismo de unión para todos los complejos es el mismo en base a una genuina compensación entropico-entálpica. Nuestros resultados muestran que la inusual estructura de barril-beta de E2C puede acomodarse a numerosas mutaciones manteniendo las propiedades cruciales de conformación y función. Pero la unión cooperativa a sitios adyacentes de ADN mostró que los componentes entálpicos-entrópicos de la reacción como la deformación del ADN puede divergir entre distintas homólogas en acuerdo con un fuerte acoplamiento entre la dinámica global de la proteína y el reconocimiento del ADN. Palabras clave: papilomavirus humano, Proteína E2 regulador maestro, Interacciones proteína-ADN, Biofísica. 3 Resumen en inglés “E2, transcription and replication regulator of human papillomavirus: protein-DNA interaction, conformational dynamics and evolutionary divergence” More than 50 Human papillomavirus (HPV) types infect mucosal epithelia causing a variety of benign and malign lesions. The C-terminal domain of HPV E2 protein (E2C) discriminates between four highly similar cognate DNA sites in order to regulate the virus life cycle by activating replication and repressing and/or activating transcription. In order to try to understand the nature of the interaction between E2C and DNA, we performed a detailed analysis of the complex using bioinformatics tools and the information content on DNA sequences and using biophysical techniques and recombinant engineered and homologous E2C proteins and synthesized specific and nonspecific DNA sites. Before studying the role of the E2C-DNA interaction, we focused on the nonfunctional polymerization process of E2C as its development is repressed by the presence of DNA binding sites. Triggered by heat, the polymerization of E2C starts by formation of a stable and structured nucleus and ends in an organized morphology landscape of soluble amyloid-like oligomers. The computational study of the E2-DNA interaction of all mucosal HPV types, indicates that E2 proteins have similar DNA discrimination properties. Differences in E2-DNA interaction among HPV types lie mostly in the target DNA sequence, in agreement with the analysis of binding of E2C to different sites using isothermal titration calorimetry. Based on DNA sequences only, we could predict differences in binding energies which clustered into six discrete affinity hierarchies. Finally, certain distances between sites, affinity hierarchies and their eventual changes upon methylation, are statistically associated with high-risk types. We studied the stability and DNA discrimination properties of five homologous E2C proteins with sequence identities ranging from 45% to 77%. Equilibrium denaturation and unfolding kinetics in guanidinium chloride showed that all five domains are very stable homodimers that unfold via a two-state mechanism. We used isothermal titration calorimetry to follow binding of the five proteins to three different DNA sites. Genuine enthalpy-entropy compensation confirms that the binding mechanism is the same for all complexes. The five domains have nearly identical capacities for DNA sequence discrimination despite the high degree of sequence divergence. Our results show that the unusual E2C beta-barrel can accommodate many mutations while retaining its crucial conformational and functional properties. But cooperative binding to tandem DNA E2 site showed that the enthalpic-entropic components of the reaction and DNA deformation can diverge in agreement with a strong coupling between global dynamics and DNA recognition. Keywords: Human papillomavirus, E2 master Regulator Protein, Protein-DNA Interactions, Biophysics. 4 5 Agradecimientos A Gonzalo por la confianza y la fuerza que me dio a lo largo de estos años de tesis doctoral en su laboratorio. Por haber sido un ejemplo de empuje y positivismo, por su inagotable creatividad y grandeza. Al financiamiento del CONICET y de la Universidad de Buenos Aires. A la casa de estudios Fundación Instituto Leloir. A las entidades que costearon cursos y congresos, AMSUD-Pasteur, SBBq y SAB. A la comunidad científica en general que fomenta el acceso gratuito de la información. A Nacho, mi gurú científico y amigo personal, por compartir lucidez, pasión y criterio, por hacer más divertidos los días en el laboratorio. A los pipeteros (carajo) del laboratorio, por estar cerca en el aliento de todos los días y mostrarme las múltiples caras de este oficio. A Marce, Kari, Santi, Clarita, Leo, Nacho, Mari-sol-kena-ángeles, María-Laura-Marta-Gaby, Ángel, Gabi, Fer, Esteban, Cris, Lucía, Sebas, Pauli, Dieg, Juan, Eleo, Dia, Ale, Ricky y a las secretarias Lili y Agus. A mantenimiento, administrativos, limpieza, droguero, técnicos, becarios, investigadores de la FIL. A todos los que compartieron conmigo sonrisas, miradas, emociones, ideas, rumores y enigmas en los pasillos, mesadas, ascensores, subsuelo, baños, droguero, cursos, veredas,