Campus de Botucatu Instituto de PG BGA Biociências CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE Rhabdias spp. (NEMATODA, RHABDIASIDAE) PARASITAS DE SERPENTES DA REGIÃO DE BOTUCATU –SP. Thomaz Henrique Barrella Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, área de concentração Biologia de parasitas e microorganismos Orientador: Reinaldo José da Silva BOTUCATU - SP 2009 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU CARACTERIZAÇÃO MORFÓLOGICA E MOLECULAR DE Rhabdias spp. (NEMATODA, RHABDIASIDAE) PARASITAS DE SERPENTES DA REGIÃO DE BOTUCATU – SP. Thomaz Henrique Barrella Orientador: Reinaldo José da Silva Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, área de concentração Biologia de Parasitas e Microorganismos BOTUCATU - SP 2009 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SELMA MARIA DE JESUS Barrella, Thomaz Henrique. Caracterização morfológica e molecular de Rhabdias spp . (Nematoda, Rhabdiasidae) parasitas de serpentes da Região de Botucatu - SP / Thomaz Henrique Barrella. – Botucatu : [s.n.], 2009. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu 2009 Orientador: Reinaldo José da Silva Assunto CAPES: 20301000 1. Serpentes - Parasito – Botucatu ( SP) 2. Nematoda 3. Biologia molecular CDD 595.182 Palavras-chave: Análise molecular; Morfologia; Rhabdias; Serpentes Resumo O gênero Rhabdias possui apenas uma espécie descrita como parasita de serpentes no Brasil, Rhabdias vellardi, com sua descrição baseada apenas na fêmea parasita, e sem estudos posteriores sobre quaisquer aspectos biológicos desse parasita. No presente estudo realizamos a caracterização morfológica e molecular dos parasitas de serpentes do gênero Rhabdias da região de Botucatu – SP. Das serpentes estudadas, 20,8% apresentaram-se positivas no exame coproparasitológico para o gênero em estudo. As amostras positivas foram submetidas a coprocultura, afim de obter as formas larvais e de vida livre para caracterização morfológica. As fêmeas partenogenéticas parasitas foram obtidas em necrópsia de serpentes que vieram a óbito no cativeiro e foram caracterizadas morfologicamente e molecularmente. A análise morfológica das formas parasitas apresentou resultados que discordam dos dados existentes para a espécie previamente descrita como parasita de serpentes do Brasil, bem como de outras espécies do gênero, o que sugere que esta seja uma nova espécie. A análise molecular do gene SSUrDNA foi inconclusiva. Abstract The genus Rhabdias has only one species described as parasite of snakes in Brazil, Rhabdias vellardi, with the description based only on the parasitic female, with no further studies on any biological aspects of this parasite. On the present study the morphological and molecular characterization of the parasites of the genus Rhabdias of snakes from the Botucatu region, São Paulo state was performed. Twenty point eight percent of the snakes were positive on the coproparasitological exams for rhabdiasid nematodes. The positive samples were submited to coproculture to obtain the free living and larval stages, in order to proceed their morphological characterization. The parasitic females were obtained from the necropsy of animals that died in captivity, and their morphological and molecular characterization was performed. The results obtained disagree with the data for the species previously described in Brazil and with other species from the genus, suggesting that this is a new species. The molecular analisys of the SSUrDNA gene was inconclusive. Agradecimentos Em primeiro lugar agradeço à minha esposa, meu grande amor, minha amiga, companheira, “chefa”, em fim, a razão pela qual vivo hoje… Evelinne, sem você não teria chegado aonde cheguei, você, por muitas vezes, foi a força que me motivou a continuar trabalhando, mesmo com tantas adversidades que se colocaram em nosso caminho ao longo desses anos. Agradeço aos meus pais por seu apoio, carinho, fé e amor. Sem vocês eu não seria o homem que sou hoje, tanto pessoal como profissionalmente, os valores que trago comigo aprendi com vocês e levarei por toda a vida. Agradeço ao Reinaldo, meu querido orientador e amigo, pois, mesmo com todos os problemas que enfrentamos me deu seu voto de confiança e a chance de mostrar meu potencial. Sei que abusei, e abuso, de sua paciência por muitas vezes, mas saiba que tenho em você uma referência de vida, um homem honesto, batalhador, dedicado e altamente altruísta, abraçando a todos que se aproximam de você como seus filhotes, protegendo das situações adversas, mas sem deixar de cobrar e exigir resultaodos, afim de que possamos crescer, amadurecer e enfim alçar voô sozinhos. Profa. Dra. Karina Rodrigues dos Santos, essa pessoa é muito mais que uma colega de trabalho, é uma amiga muito especial, sem a qual acredito que nunca teria terminado este trabalho. Mais uma vez peço desculpas pelos tanstornos que lhe causei, e vou lhe agradecer eternamente por toda ajuda. Eriquinha! Essa menina chegou de mansinho, entrou no grupo quietinha e ganhou o coração de todos com seu jeito carinhoso, amigo e solidário. Seu apoio e auxílio foram muito importante nesses anos de convivência, que espero se estendam por muitos e muitos mais, mas agora sem tanta pressão… Saiba que esteja aonde estiver você sempre terá seu amigo pronto a lhe ajudar, ouvir, aconselhar e divertir, pois a vida não é só trabalho. Agradeço a todos os amigos de laboratório e departamento por sua amizade, pelas palavras de carinho e apoio, vocês farão parte de minha vida para sempre, pois com cada uma de vocês aprendi algo diferente que levarei comigo para sempre. Agradeço ao CEVAP e toda sua equipe pela oportunidade e apoio. Obrigado Deus por me guardar e permitir que eu chegasse até onde cheguei. Sumário Revisão de literatura...................................................................................................................1 Introdução.......................................................................................................................2 Revisão de literatura.......................................................................................................3 As serpentes........................................................................................................3 Trematódeos de serpentes brasileiras.................................................................5 Cestódeos de serpentes brasileiras.....................................................................5 Nematódeos de serpentes brasileiras..................................................................6 Gênero Rhabdias................................................................................................6 Caracterização molecular das espécies do gênero Rhabdias..............................9 Artigo1: Rhabdias filicaudalis n. sp. (Nematoda, Rhabdiasidae) from the snake Spilotes pullatus (Linnaeus, 1758) (Serpentes, Colubridae).………………….....…..……….........11 Artigo2: Morphological analysis of Rhabdias sp. (Nematode, Rhabdiasidae) parasites of snakes(Reptilia, Serpentes) from the Botucatu region, São Paulo state, Brasil...............24 Artigo3: On the life cycle of Rhabdias filicaudalis (Nematoda, Rhabdiasidae).…...……..32 Artigo4: Molecular data of Rhabdias filicaudalis (Nematoda, Rhabdiasidae) from brazilian snakes......................................................................................................................39 Considerações gerais................................................................................................................47 Referências bibliográficas........................................................................................................49 1 Revisão de literatura 2 Introdução Os répteis podem ser parasitados por diversos agentes, entre eles, artrópodes, protozoários e helmintos. As serpentes (Reptilia, Squamata) estão sujeitas a todos esses agentes parasitários, fazendo parte desse grupo de parasitas, os nematódeos pertencentes ao gênero Rhabdias(Nematoda, Rhabdiasidae), que habitam no pulmão da serpente, podendo levar a alterações clínicas relevantes (Santos et al., 2008). A criação de serpentes em cativeiro, prática em franco crescimento, principalmente em regime semi-extensivo, é uma atividade que expõe os animais à ação de diversos parasitas (Mader, 1996). A prevalência de parasitas de ciclo monoxênico é mais elevada do que aqueles de ciclo heteroxênico, pois este último necessita de um hospedeiro intermediário para que o ciclo se complete (Smyth, 1994). A transmissão de parasitas de ciclo monoxênico é favorecida pelas condições físicas e orgânicas do cativeiro e, desse modo, uma serpente pode contaminar outros animais ou mesmo se recontaminar com agentes parasitários de suas próprias fezes. Além disso, a condição de cativeiro ou o estresse relacionado a essa condição pode ser responsável pela aquisição ou pelo aumento na infecção parasitária (Klingenberg, 1993). Por esses motivos, as infecções parasitárias têm sido um dos grandes problemas para a criação de serpentes em cativeiro e cada vez mais vem despertando a atenção da comunidade científica. Nesse sentido, Araujo et al. (1999) necropsiaram