Phosphatidylserin- (PS) und Phosphatidylglycerol- (PG) angereicherte nanoskalige Formulierungen als antiinflammatorische Agentien: Herstellung und umfassende Charakterisierung Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Naturwissenschaftlichen Fakultät I – Biowissenschaften – der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, vorgelegt von Frau Dipl.-Pharm. Miriam Elisabeth Klein geb. am 17.07.1989 in Friedrichroda Gutachter: 1. Prof. Dr. Karsten Mäder 2. PD Dr. Annette Meister 3. Prof. Dr. Heiko Heerklotz Datum der öffentlichen Verteidigung: 08.04.2021 Sapere aude! Habe Mut, Dich Deines eigenen Verstandes zu bedienen! Immanuel Kant, Philosoph der Aufklärung Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................................. III 1 Einleitung ................................................................................................................................... 1 1.1 Entzündung ......................................................................................................................... 1 1.1.1 Allgemeines .................................................................................................................. 1 1.1.2 Ablauf der Entzündungsreaktion ................................................................................... 1 1.1.3 Therapie der Entzündung ............................................................................................. 2 1.1.4 Monozyten/Makrophagen als Therapie-Target .............................................................. 3 1.2 Akuter Myokardinfarkt .......................................................................................................... 4 1.3 Phosphatidylserin ................................................................................................................ 5 1.4 Phosphatidylglycerol ........................................................................................................... 7 1.5 Nanoskalige Formulierungen ............................................................................................... 8 1.5.1 Allgemeines .................................................................................................................. 8 1.5.2 Liposomen .................................................................................................................... 8 1.5.3 Mischmizellen ............................................................................................................... 9 1.6 Zielstellung ........................................................................................................................ 11 2 Material und Methoden............................................................................................................. 13 2.1 Allgemeines ....................................................................................................................... 13 2.2 Handhabung und Lagerung von Phospholipiden ............................................................... 13 2.3 Herstellung nanoskaliger Formulierungen ......................................................................... 14 2.3.1 Herstellung der Liposomen ......................................................................................... 14 2.3.2 Herstellung der Mischmizellen .................................................................................... 15 2.4 In vitro Charakterisierung .................................................................................................. 16 2.4.1 Chemische Analytik .................................................................................................... 16 2.4.2 Physikochemische Analytik ......................................................................................... 17 2.4.3 Biologische Analytik .................................................................................................... 20 2.4.4 Biochemische und immunologische Analytik ............................................................... 24 2.5 In vivo und ex vivo Charakterisierung ................................................................................ 27 2.5.1 Allgemeines ................................................................................................................ 27 2.5.2 Mäuse ........................................................................................................................ 27 2.5.3 Experimentelles Versuchsdesign ................................................................................ 27 2.5.4 In vivo und ex vivo Analytik ......................................................................................... 29 2.6 Statistik ............................................................................................................................. 32 3 Ergebnisse und Diskussion ...................................................................................................... 33 3.1 Etablierung der Zellkulturmethoden ................................................................................... 33 3.1.1 Hämolyse ................................................................................................................... 33 I Inhaltsverzeichnis 3.1.2 Aktivität peritonealer Mausmakrophagen .................................................................... 34 3.2 Liposomen ......................................................................................................................... 40 3.2.1 Allgemeines ................................................................................................................ 40 3.2.2 Physikochemische Charakterisierung ......................................................................... 41 3.2.3 Stabilitätsuntersuchungen .......................................................................................... 47 3.2.4 Biologische Charakterisierung in vitro ......................................................................... 52 3.2.5 Biologische Charakterisierung in vivo und ex vivo ...................................................... 63 3.3 Mischmizellen .................................................................................................................... 74 3.3.1 Allgemeines ................................................................................................................ 74 3.3.2 Physikochemische Charakterisierung ......................................................................... 75 3.3.3 Stabilitätsuntersuchungen .......................................................................................... 84 3.3.4 Biologische Charakterisierung in vitro ......................................................................... 86 4 Zusammenfassung und Ausblick .............................................................................................. 95 5 Summary and Outlook.............................................................................................................. 97 6 Literaturverzeichnis .................................................................................................................. 99 7 Anhang .................................................................................................................................. 111 II Selbständigkeitserklärung ...................................................................................................... XIII III Danksagung .......................................................................................................................... XIV IV Lebenslauf ............................................................................................................................ XVI V Veröffentlichungen ............................................................................................................... XVIII II Abkürzungsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis % Prozent °C Grad Celsius λEx Anregungswellenlänge λEm Emissionswellenlänge µ mikro = 10-6 3T3 murine Fibroblasten-Zelllinie Å Angström = 10-10 m ACE Angiotensin-Converting-Enzym ad libitum nach Belieben ANOVA Analysis of Variance (multifaktorielle Varianzanalyse) APC Allophycocyanin APZ apoptotische Zelle ASTM American Society for Testing and Materials ATP Adenosintriphosphat BP Schmalband bzw. beziehungsweise C57BL/6J WT Mausstamm, Inzucht, immunkompetent c centi = 10-2 ca. circa CD14 Glykoprotein CD14 CD4+ Glykoprotein CD4 positiv (exprimierend) CD8+ Glykoprotein CD8 positiv (exprimierend) CMC Critical Micelle Concentration (kritische Mizellbildungskonzentration) CMT Critical Micellization Temperature (kritische Mizellbildungstemperatur) COX-2 Cyclooxygenase 2 d Tag DAPI 4‘,6-Diamidino-2-Phenylindol DiI 1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-Tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat DiR 1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-Tetramethylindotricarbocyanin-Iodid DLS dynamische Lichtstreuung DMARD Disease Modifying Anti-rheumatic Drug (Basistherapeutikum) DMEM Dulbecco’s modified Eagle Medium DOPG 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) Natrium DOPS 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin Natrium DPPC 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin DPPG 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol) Natrium III Abkürzungsverzeichnis DSC Differential Scanning Calorimetry (differentielle Leistungskalorimetrie) DSPC 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin DSPG 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol) Natrium DSPE-PEG-2000, PEG 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy