Control of adventitious root formation in the alpine perennial Arabis alpina I n a u g u r a l - D i s s e r t a t i o n zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Priyanka Mishra aus Cuttack, India Köln, 2019 Berichterstatter: Jun-Prof. Dr. Maria Albani Prof. Dr. Stanislav Kopriva Prüfungsvorsitz: Prof. Dr.Michael Ute Höcker Bonkowski Tag der letzten mündlichen Prüfung: .........................................15.02.2019 II Dedicated to my parents for everything III IV Abstract Successful adventitious root development ensures the efficient clonal propagation of alpine perennials under harsh environmental conditions, but the molecular basis of this process is not well understood. I used the alpine perennial Arabis alpina to explore natural variation of adventitious rooting and investigate the molecular basis of adventitious root development in alpine perennials. Plants of the A. alpina accessions, Pajares (Paj), Dorfertal (Dor), Totes Gebirge (Tot) and West Carpathians (Wca), and the perpetual flowering 1-1 (pep1-1) mutant were scored after growth in a long day greenhouse. The occupancy of adventitious roots on the hypocotyl, main stem and axillary branches varied between genotypes. Especially, Wca plants produced adventitious roots on the main stem, which correlated with the higher expression of the A. alpina homolog of GH3.3. Exogenous auxin application by foliar spraying promoted adventitious root formation robustly in a genotype and age-dependent manner. I also applied auxin spray on vernalized Paj plants and scored the presence of adventitious roots on stems after plants were transferred in long day greenhouse. Adventitious roots developed from the vascular cambium cells specifically on younger internodes. High-throughput RNA sequencing revealed the differential regulation of auxin transporter genes in the internodes that produce adventitious roots compared to the ones that do not, indicating a key role for polar auxin transport during the induction of adventitious rooting after auxin spray. Auxin-responsive genes showed internode-specific transcript accumulation in response to auxin spray, which correlated with their rooting ability. In addition, transcripts of several meristem-associated genes were enhanced in the internodes that develop adventitious roots after auxin spray, indicating the establishment of root primordium during vernalization. Extended vernalization overcame the requirement to spray with synthetic auxin for the development of adventitious roots. After 21 weeks of vernalization, adventitious roots developed in young internodes and transcriptome profiling indicated the presence of initiator cells during vernalization and the involvement of auxin during the establishment of the initiator cells. V VI Zusammenfassung Die erfolgreiche Ausbildung von Adventivwurzeln garantiert die effiziente klonale Vermehrung von alpinen mehrjährigen Pflanzen unter rauen Umweltbedingungen, die molekularen Grundlagen sind bisher jedoch kaum erforscht. In meiner Arbeit nutzte ich die alpine mehrjährige Arabis alpina um die natürliche Variation der adventiven Wurzelbildung zu erfassen und die molekularen Grundlagen der Adventivwurzel-Entwicklung in alpinen mehrjährigen zu erforschen. Die A. alpina Akzessionen Pajares (Paj), Dorfertal (Dor), Totes Gebirge (Tot) und West Carpathians (Wca), sowie die perpetual flowering 1-1 (pep1-1) Mutante wurden unter Langtag Gewächshausbedingungen bezüglich der adventiven Wurzelbildung phänotypisiert. Das Vorhandensein von Adventivwurzeln an Hypokotyl, Hauptspross und Seitentrieben variierte zwischen den Genotypen. Insbesondere bei Wca Pflanzen kam es zur Ausbildung von Adventivwurzeln am Hauptspross und dies korrelierte mit einer stärkeren Expression des A. alpina Homologes von GH3.3. Das Sprühen mit exogenem Auxin führte zu einer reproduzierbaren genotyp- und altersabhängigen Förderung der adventiven Wurzelbildung. Zusätzlich wurden vernalisierte Paj Pflanzen mit exogenem Auxin behandelt, in Langtag Gewächshausbedingungen transferiert und das Vorhandensein von Adventivwurzeln am Hauptspross ausgewertet. Ausschließlich bei jüngeren Internodien bildeten die Zellen des vaskulären Kambiums Adventivwurzeln aus. Eine Hochdurchsatz-Transkriptom-Sequenzierung enthüllte, dass Auxin- Transporter Gene zwischen wurzelschlagenden und wurzellosen Internodien differenziell reguliert waren. Dies deutet auf eine Schlüsselfunktion des polaren Auxintransports in der Induktion von Adventivwurzeln im Zusammenhang mit der Applikation von exogenem Auxin. „Auxin- responsive genes”, die durch Auxin Signalwege aktiviert werden, zeigten ebenso eine Internodium-spezifische Akkumulation und dies korrelierte mit der Fähigkeit zur adventiven Wurzelbildung. Darüber hinaus waren die Transkripte mehrerer Meristem-assoziierter Gene in nach der Auxin-Behandlung wurzelschlagenden Internodien angereichert, was auf die Anlage von Wurzelprimordien währened der Vernalisierung hindeutet. Die Erfordernis der synthetischen Auxin-Gabe zur Ausbildung von Adventivwurzeln wurde mit einer verlängerten Vernalisierung überwunden. Nach 21 Wochen Vernalisierung entwickelten sich Adventivwurzeln in jungen Internodien. Eine Transkriptomanalyse deutete auf die Anwesenheit von Initiatorzellen und eine Beteiligung von Auxin in der Anlage jener Zellen während der Vernalisierung hin. VII VIII Table of Contents Abstract……………………......…………………………………………….………………………………………………………………V Zusammenfassung…..………...………………………………………………..…………………………………………………… VII Table of Contents...……………………………………………………………….…………………………………………………….IX 1. INTRODUCTION .............................................................................................................. 1 1.1. The importance of clonal propagation in the perennial life cycle .........................................1 1.2. Adventitious roots as a means of clonal propagation ..........................................................1 1.3. Adventitious root development ..........................................................................................2 1.4. Regulation of adventitious root development .....................................................................3 1.4.1. Auxin ...................................................................................................................................................... 3 1.4.2. Other hormones .................................................................................................................................... 5 1.4.3. Low temperature ................................................................................................................................... 7 1.5. A. alpina clonally propagates in nature using adventitious roots .........................................8 1.6. Auxin induces adventitious root development in diverse species ........................................9 1.7. Genetic approaches to study adventitious root formation ...................................................9 1.8. Research aims .................................................................................................................. 10 2. RESULTS ....................................................................................................................... 11 2.1. A. alpina shows natural variation in adventitious rooting .................................................. 11 2.1.1. A. alpina produces adventitious roots in the greenhouse ................................................................... 11 2.1.2. GH3.3 and GH3.6 homologs during adventitious rooting in natural accessions of A. alpina .............. 13 2.1.3. Auxin spray induces adventitious root formation in an age-, day length, -dosage- and genotype- dependent manner ............................................................................................................................................ 14 2.1.4. Auxin spray affects A. alpina ecotypes in diverse ways ....................................................................... 19 2.1.5. Identification of A. alpina mutants affected in adventitious rooting .................................................. 21 2.2. Differential regulation of hormonal responses regulates adventitious root formation in vernalized A. alpina following auxin spraying ............................................................................... 24 2.2.1. Auxin spray induces adventitious root development on specific internodes of vernalized A. alpina plants….. ............................................................................................................................................................. 24 2.2.2. Transcriptomic profiling after auxin spray application reveals hormonal signalling as a determinant of adventitious rooting in A. alpina.................................................................................................................... 26 2.2.3. Adventitious root induction and initiation take place 6 and 24 h after auxin spraying....................... 34 2.2.4. Adventitious root elongation takes place 72 and 120 h after auxin spray .......................................... 38 IX 2.2.5. Members of the SAUR and AUX/IAA families are differentially regulated throughout adventitious rooting… ............................................................................................................................................................. 41 2.2.6. Differential auxin responsiveness between internodes before auxin