Study of the oral virome and microbiome associated to the proliferative verrucous leukoplakia Doctorando: Rodrigo García López Programa: 1393/2007 Biotecnología, FACULTAT DE CIÈNCIES BIOLÒGIQUES Directores: Andrés Moya Simarro Vicente Pérez Brocal Valencia, 2017 D. Andrés Moya, Catedrático del Departamento de Genética de la Universitat de València y D. Vicente Pérez Brocal, Investigador del Centro de Investigación Biomédica en Red (Epidemiología y Salud Pública) (CIBERESP), certifican que la memoria titulada “Study of the oral virome and microbiome associated to the proliferative verrucous leukoplakia” ha sido realizada bajo su dirección en la Unidad Mixta de Investigación en Genómica y Salud FISABIO-Salud Pública -Instituto Cavanilles de Biodiversidad y Biologia Evolutiva, Universitat de València. Y para que así conste, firman el presente certificado. Fdo. Dr. Andrés Moya Fdo. Dr. Vicente Pérez Brocal Valencia, a _____________________________________________ Agradecimientos A mi esposa, Letty por el enorme apoyo y cariño en estos momentos tan complicados. A Andrés por su interminable paciencia y la motivación para seguir adelante. A Vicente y Ma. José por la valiosa guía tanto en lo académico como en la vida. A Jorge y Bea por la amistad que tanta falta hace para poder disfrutar del trabajo. A Maria por marcar la pauta y recordarme siempre hay algo positivo en todo. A los compañeros del laboratorio por la convivencia y a los técnicos por su imprescindible ayuda. A los que ya no están, los que nos dejaron pero a quienes recordamos con mucho cariño. A mi papá, por los valiosos consejos que quisiera seguir más frecuentemente. A mi mamá por ser quien me aterriza en la realidad cuando divago. A mis hermanos, por recordarme que no todo en la vida es trabajo. A La Bola, por recordarme que la amistad es para toda la vida. A los amigos familiares y compañeros que me ayudaron a llegar a este punto y muchos nombres que no olvido pero que no hace falta mencionar para saber que los estimo y siento su apoyo. A todos, mis más sinceras gracias. "WE ARE ALL LIKELY TO MAKE MISTAKES, EXCEPT THOSE OF US WHO DO NOTHING." C. BERNARD AN INTRODUCTION TO THE STUDY OF EXPERIMENTAL MEDICINE, 1865 “THE DEVELOPMENT OF SOMETHING NEW, EVEN IN HUMAN ENDEAVOUR, IS GENERALLY THE OUTCOME OF EFFORTS MANY OF WHICH YIELD ONLY NEGATIVE RESULTS.” A. J. KLUYVER AND C. B. VAN NIEL, THE MICROBE'S CONTRIBUTION TO BIOLOGY, 1956 La realización de este trabajo fue apoyada por proyectos del Ministerio de Economía y Competitividad de España SAF 2012-31187, SAF2013-49788-EXP y SAF2015-65878-R, la beca de Formación de Personal Investigador del Ministerio de Ciencia e Innovación de España y la beca CONACYT-CECTI del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México y el Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Michoacán. TABLE OF CONTENTS INTRODUCTION ....................................................................................................................................... 1 General Introduction ........................................................................................................................... 1 It is a small world after all .............................................................................................................. 1 Towards a multi-omics era ............................................................................................................. 1 Box 1.- Important definitions ......................................................................................................... 2 Rise and fall of sequencing platforms ............................................................................................ 5 Box 2 – Meta-omics ....................................................................................................................... 6 Studying microbiota ........................................................................................................................... 9 Resident microbiota........................................................................................................................ 9 Human microbiota ........................................................................................................................ 10 Box 3 - Large-Scale Projects ........................................................................................................ 11 Gut to Thrive or Die ..................................................................................................................... 13 The complete picture .................................................................................................................... 15 Establishment and maturation of human microbiota .................................................................... 18 Oral fixation ...................................................................................................................................... 20 Anatomy and Physiology of the Human Oral Cavity ................................................................... 20 Histology of the oral mucosa ........................................................................................................ 24 The oral cavity as an ecological niche .......................................................................................... 28 Exploring the culturable oral microbiota ...................................................................................... 30 Box 4 – Heirs of Rosebury ........................................................................................................... 31 Beyond the culturable ................................................................................................................... 35 Oral lesions ....................................................................................................................................... 45 Oral leukoplakia and malignant transformation ........................................................................... 45 A more aggressive form – the case of proliferative verrucous leukoplakia ................................. 47 Box 5 – Diagnosis of PVL. .......................................................................................................... 49 Oral squamous cell carcinoma ..................................................................................................... 51 Viruses .............................................................................................................................................. 54 Beyond the veil ............................................................................................................................ 54 Viruses – A story of world domination ........................................................................................ 56 History and discovery of viruses .................................................................................................. 56 Replication .................................................................................................................................... 58 Classification ................................................................................................................................ 60 Confirmed oral viruses ................................................................................................................. 63 The larger picture – Going viral in metagenomics ....................................................................... 64 The human virome ........................................................................................................................ 66 Some details on techniques for studying the microbiota .............................................................. 69 HYPOTHESIS AND OBJECTIVES OF THE THESIS............................................................................ 75 Objective 1: Discarding oncogenic viruses as potential aetiological agents. ................................ 75 Objective 2: Constructing adequate bioinformatic tools for studying the metagenomics datasets. ...................................................................................................................................................... 75 Objective 3: Studying the bacterial and viral composition in search of an aetiological agent. ..... 76 MATERIALS AND METHODS .............................................................................................................. 77 A) EXPERIMENTAL PROCEDURES ................................................................................................ 77 Oncogenic DNA viruses screening in three groups of lesions and controls ..................................... 77 Participants and sample collection................................................................................................ 77 DNA Extraction ............................................................................................................................ 77 PCR amplification ........................................................................................................................ 78 Sequencing and informatic processing ......................................................................................... 80 Exploration of the microbiome and virome in three groups of lesions and controls ......................... 80 Participants and sample collection................................................................................................ 80 Nucleic acid extraction ................................................................................................................