Nanocapillaries combined with optical tweezers as a single molecule technique for studying DNA-protein complexes THÈSE NO 7608 (2017) PRÉSENTÉE LE 7 AVRIL 2017 À LA FACULTÉ DES SCIENCES ET TECHNIQUES DE L'INGÉNIEUR LABORATOIRE DE BIOLOGIE À L'ÉCHELLE NANOMÉTRIQUE PROGRAMME DOCTORAL EN BIOTECHNOLOGIE ET GÉNIE BIOLOGIQUE ÉCOLE POLYTECHNIQUE FÉDÉRALE DE LAUSANNE POUR L'OBTENTION DU GRADE DE DOCTEUR ÈS SCIENCES PAR Roman BULUSHEV acceptée sur proposition du jury: Prof. Ph. Renaud, président du jury Prof. A. Radenovic, directrice de thèse Prof. U. Keyser, rapporteur Prof. R. Lim, rapporteur Prof. S. Maerkl, rapporteur Suisse 2017 "Unless you try to do something beyond what you have already mastered, you will never grow." — Ronald E. Osborn Abstract Interactions of proteins with DNA are essential for carrying out DNA’s biological functions and performing a cellular cycle. Such processes as DNA replication, expression and repair are performed by an organised action of various proteins. To better understand the function of protein machinery many methods have been developed over the years. They can be divided into two categories: single molecule and bulk techniques. In comparison to bulk experiments, where the effect of an ensemble of proteins is measured, single molecule techniques analyse each molecule one by one. This fact allows to detect rare events and avoid averaging over the population. Moreover, some single molecule techniques can be used for measuring dynamics and active processes of biomolecules. The objective of this thesis was to make a single molecule technique combining nanocapillaries and optical tweezers for characterisation of DNA-protein complexes. There were three main steps in this thesis: 1) building and characterisation of the setup 2) using it for detection and characterisation of DNA-protein complexes and 3) localisation and discrimination of DNA-protein complexes. On the first step of the project we combined two single molecule techniques: optical tweezers and glass nanocapillaries. We characterised the electrophoretic force acting on DNA in this setup by using nanocapillaries with openings of different sizes, at different applied voltages and with DNA molecules of different lengths. We observed that the position-dependent electrophoretic force acting on the DNA depends on all above mentioned parameters. We modelled the system and found out that this effect is due to a non uniform distribution of the potential inside the nanocapillary, which originates from its elongated shape. After having built and characterised the setup, we detected proteins bound to DNA during their controlled translocation through the opening. The proteins were visualised by a sudden decrease in the force acting on the bare DNA followed up by its slow restoration when the capillary was moved further away. We made a stochastic model to explain this force profile. From the fits of the model to experimental results we extracted the effective charges of DNA- protein complexes inside the nanocapillary. In the case of all three proteins (RecA, EcoRI and RNAP) the effective charge was of opposite sign than the one in solution. We attributed this fact to the dominant impact of the drag force in comparison to the electrostatic force inside the nanocapillary. In the last step of the project we showed the ability to localise and discriminate DNA-protein Abstract complexes in our setup using dCas9 and RNAP proteins. During controlled translocation of the DNA-protein complexes we measured multiple parameters, including protein’s location on the DNA, work required to translocate the complex, and conductance change. We demonstrated that the measured location of the proteins is shifted from the designed binding site. We made a model that explained this phenomenon and that can account for the shift in our experiments. In addition, protein-specific work and conductance parameters allowed us to discriminate between RNAP and dCas9 proteins. Key words: optical tweezers, glass nanocapillary, solid-state nanopore, DNA translocation, single molecule measurements, force measurements, DNA-protein complex, protein binding site. i Résumé Les interactions entre les protéines et l’ADN sont nécessaires pour réaliser les fonctions biologiques de l’ADN et pour accomplir un cycle cellulaire. Les processus tels que la réplication, l’expression et la réparation de l’ADN sont faites par les actions organisées de différentes protéines. Au fil des années, beaucoup de méthodes pour découvrir les fonctions des protéines ont été développées. Elles peuvent être classifiées comme des techniques à molécule unique ou d’ensemble. En comparaison les expériences d’ensemble où l’effet d’un groupe de protéines est mesuré, les techniques à molécule unique analysent chaque molécule une par une. Par conséquent, les évènements rares peuvent être détectés. Par ailleurs, quelques techniques à molécule unique peuvent être utilisés pour les manipulations mécaniques de biomolécules, c.-à-d. : la torsion, l’étirement, etc. Le but de cette thèse est l’introduction de la technique qui combine les nanocapillaires et les pinces optiques pour caractériser les complexes de ADN-protéine. Il y a eu trois étapes dans ma thèse : 1) la construction et la caractérisation de l’installation expérimentale 2) la détection et la caractérisation des complexes d’ADN-protéine et 3) la localisation et la discrimination des complexes d’ADN-protéine. D’abord, nous avons combiné deux techniques à molécule unique : les pinces optiques et les nanocapillaires de verre. Dans cette installation nous avons caractérisé la force sur l’ADN en utilisant les nanocapillaires avec des pores de tailles différentes, des voltages différents et avec de l’ADN de différente longueur. La force électrostatique dépend de tous les paramètres ci-dessus. Nous avons fait un modèle de notre système et nous avons trouvé que c’est grâce à la distribution non uniforme du potentiel à l’intérieur du nanocapillaire qui vient de sa forme allongée. Après avoir construit et caractérisé l’installation nous avons détecté des protéines attachées à l’ADN pendant la translocation contrôlée à travers le nanocapillaire. Les protéines ont été dé- tectées par une brusque réduction de la force sur l’ADN accompagnée par sa lente restauration pendant le déplacement continu du nanocapillaire. Nous avons fait un modéle stochastique pour expliquer ces profils et nous avons calculé les charges effectives des protéines dans le nanocapillaire. Pour toutes les protéines (RecA, EcoRI et RNAP) la charge effective observée est de signe opposé à celle en solution. Nous avons expliqué cet effet par la force de traînée (due à l’écoulement hydrodynamique) plus forte que la force électrostatique. La derniére étape a été de localiser et de discriminer des complexes d’ADN-protéine avec les ii Abstract protéines dCas9 et RNAP.Pendant la translocation contrôlée nous avons mesuré les paramétres différents, y compris : le site d’attache des protéines, le travail requis pour une translocation de complexe et le changement de la conductivité. Nous avons démontré que le site d’attache des protéines mesuré est déplacé du site de liaison théorique. Nous avons fait un modéle pour expliquer cet effet et corriger le site d’attache mesuré. De plus, les travaux et les conductivités mesurés nous ont permis de discriminer entre les complexes de RNAP et dCas9. Mots-clés : pinces optiques, nanocapillaires de verre, solid-state nanopore, translocation d’ADN, expérience à molécule unique, mesure de la force, complexes d’ADN-protéine, sites de liaison des protéines. iii Contents Abstract (English/Français) List of figures vii List of tables ix 1 Introduction 1 1.1Opticaltweezers...................................... 2 1.1.1 Principle and calibration . 2 1.1.2 Studying DNA-protein interactions . 4 1.2 Nanopores . 7 1.2.1 Types of nanopores and principle of sensing . 7 1.2.2 Detection of DNA-protein complexes . 9 1.3 Nanopores/nanocapillaries combined with optical tweezers . 10 1.3.1 Combination of nanopores with optical tweezers . 11 1.3.2 Combination of nanocapillaries with optical tweezers . 13 2 Methods 15 2.1 Fabrication of nanocapillary-based devices . 15 2.1.1 Laser-assisted pulling . 15 2.1.2 Shrinking . 16 2.1.3 Integration in a fluidic cell . 17 2.1.4 Passivation of capillary walls with lipids . 19 2.2 Combination of nanocapillaries with optical tweezers . 21 2.2.1 Setup description . 21 2.2.2 Formation of bead-DNA complexes . 22 2.2.3 Calibration of optical tweezers . 24 2.3 Sensing of biomolecules in nanocapillaries . 26 2.3.1 Free translocations . 26 2.3.2 Controlled translocations . 26 2.4 Formation and detection of DNA-protein complexes . 30 2.4.1 Formation of DNA-protein complexes . 30 2.4.2 Methods for detection of DNA-protein complexes . 33 2.5 Model of a nanocapillary . 36 v Contents 2.5.1 Analytical calculations of the potential . 36 2.5.2 COMSOL finite element model . 37 2.6 Model of a DNA-protein complex inside a nanocapillary . 39 2.6.1 Calculation of the drag force on proteins in COMSOL . 39 2.6.2 Stochastic model of controlled translocations . 39 2.6.3 Analytical solution for a protein localisation shift . 46 2.6.4 Equilibrium information from protein jump events . 49 3 Results and discussion 51 3.1 Measurement of the position-dependent electrophoretic force on DNA in a glass nanocapillary . 51 3.1.1 Effect of the nanocapillary size and DNA length on the force magnitude 51 3.1.2 Measurement of position-dependent force profiles . 54 3.1.3 Explanation of position-dependent force profiles . 56 3.1.4 Conclusions . 61 3.1.5 Supplementary movies . 61 3.2 Relevance of the drag force during controlled translocation of a DNA-protein complex through a glass nanocapillary . 62 3.2.1 Detection of DNA-bound proteins with nanocapillaries and optical tweezers 62 3.2.2 Discussion of force profiles of DNA-protein complexes . 70 3.2.3 Discussion of conductance drops of DNA-protein complexes .