PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE POSGRADO MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS IDENTIFICACIÓN DE HÍBRIDOS EN LULO ( Solanum quitoense Lam. ) Y TOMATE DE ÁRBOL ( Solanum betaceum Cav. ) MEDIANTE EL USO DE MARCADORES COSII ZULMA ESPERANZA CÁRDENAS CONTRERAS ÉNFASIS EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL Bogotá, D. C., Colombia Octubre 2009 PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE POSGRADO MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS IDENTIFICACIÓN DE HÍBRIDOS EN LULO ( Solanum quitoense Lam. ) Y TOMATE DE ÁRBOL ( Solanum betaceum Cav. ) MEDIANTE EL USO DE MARCADORES COSII ZULMA ESPERANZA CÁRDENAS CONTRERAS Directora: LUZ STELLA BARRERO MENESES PhD. Genética Molecular Vegetal Trabajo de Grado Presentado como requisito parcial Para optar al título de: MAGISTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Énfasis en Biotecnología Vegetal Bogotá, D. C., Colombia Octubre 2009 NOTA DE ADVERTENCIA “La Pontificia Universidad Javeriana no se hace responsable por los conceptos, criterios, opiniones y conclusiones expresados por sus alumnos, solo velará por que el trabajo no tenga ataques personales y únicamente se vea en él, el anhelo de buscar la verdad y justicia”. Artículo 23 de la Resolución No. 13 de Julio de 1996. IDENTIFICACIÓN DE HÍBRIDOS EN LULO ( Solanum quitoense Lam.) Y TOMATE DE ÁRBOL ( Solanum betaceum Cav. ) MEDIANTE EL USO DE MARCADORES COSII Zulma Esperanza Cárdenas Contreras APROBADO ______________________ ______________________ Dra. Luz Stella Barrero Meneses Dra. María del Pilar Márquez PhD. Genética Molecular Vegetal MSc. Agricultura Ecológica Directora Jurado _______________________ _______________________ Dr. Gerardo Moreno Dr. Wilson Terán MSc. Ciencias Biológicas PhD. Bioquímica y Biología Molecular Jurado Jurado IDENTIFICACIÓN DE HÍBRIDOS EN LULO ( Solanum quitoense Lam .) Y TOMATE DE ÁRBOL ( Solanum betaceum Cav.) MEDIANTE EL USO DE MARCADORES COSII Zulma Esperanza Cárdenas Contreras _________________________ ___________________________ Dra. Ingrid Schuler PhD. Dr. Manuel Franco PhD. Decana Académica Director de Posgrados Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias Dedicatoria Con todo mi amor: A NuestroDios y la Virgen Santísima que me permiten con su inmenso amor, reflejado mi familia, amigos y las cosas más sencillas, crecer como profesional y sobre todo en mi vida espiritual soy mejor gracias a ustedes y es mi deber seguir mejorando. Mi hermosa Madre Presentación, digna de admirar y un ejemplo permanente de amor, con tus enseñanzas y oraciones fue posible y será posible todo lo que me proponga. Mi padre, Gabriel soñador y luchador incansable. Mis hermanos: Andrés, Nelson,Wilson, Gabriel y Ma Helena, su apoyo, enseñanzas y amor llenan cada día mi vida de la mejor energía. Mis sobrinas Gabrielle, Marianne y Valerie, mis princesas, me enseñan a cada instante que amar es la mejor forma de aprender. A mis abuelas, abuelos y Susana que desde el cielo están apoyándome. A mi país Colombia, a toda su buena gente, a los campesinos y agricultores que de una u otra forma aportan al mejoramiento fitogenético por quienes profeso gran admiración y respeto. AGRADECIMIENTOS Doctora Luz Stella Barrero, directora y orientadora de este proyecto, por permitirme hacer parte de este estudio, por su paciencia y colaboración. Doctor Mario Lobo y Doctora Clara Medina, por suministrar el material híbrido desarrollado en el programa de mejoramiento del C.I. La Selva para los análisis moleculares y su orientación. Doctores Rodrigo Martínez y Víctor Núñez por su asesoría conceptual y de laboratorio. MSc. Oscar Bedoya, por su colaboración en el análisis de datos, bioinformática y revisión de estilo, en la parte final de este proyecto. Mis compañeras de laboratorio y sobre todo amigas Girley Collazos, Silvia Gómez, Linda Gómez, Natalia Espinosa y Carolina Ospina, por todos sus aportes y apoyo permanentes que hicieron posible el éxito en el laboratorio. Iván Fernando Calixto, por su colaboración en la etapa final de la parte experimental y análisis de secuencias, pero sobre todo por su amistad y constante preocupación. Aura Yaneth Camargo y Félix Enciso por su colaboración y permanente apoyo en la asistencia técnica y logística. A Felix gracias por suministrarme información valiosa para el documento. Mis hermanos Andrés Cárdenas y Gabriel Cárdenas, por su apoyo incondicional, por impulsarme en este reto académico y su apoyo económico permanente. Mis mejores amigas Diana Millán, Heydi Manrrique y Saira Espinosa, por su valioso y permanente apoyo desde su condición de madres y excelentes profesionales. Ivanov Pineda por su apoyo y por todos los momentos compartidos en estos años. Ligia Suescun por su aporte en el manejo de cultivo de tejidos de una parte del material vegetal. Al profesor Steven D. Tanksley y Feinan Wu, Universidad de Cornell, por suministrar información sobre los marcadores COSII, a través de la directora de este proyecto. A COLCIENCIAS por el apoyo financiero y a CORPOICA por facilitar las instalaciones de laboratorio. A todas aquellas personas que de una u otra manera contribuyeron al buen término de este trabajo, a todos gracias. INDICE GENERAL Páginas RESUMEN 1 ABSTRACT 2 1. INTRODUCCIÓN 3 1.1. Planteamiento del problema y Justificación 3 1.2. Objetivos 5 1.2.1. Objetivo general 5 1.2.2. Objetivos específicos 5 1.3. Alcance del proyecto 5 2. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS 6 2.1. Familia solanácea 6 2.2. Tomate de árbol ( Solanum betaceum, Cav. Sent.) 6 2.2.1. Origen y distribución 7 2.2.2. Taxonomía 7 2.2.3. Morfología 8 2.2.4. Variedades 8 2.2.5. Producción Nacional 8 2.2.6. Composición físico-química y uso del fruto 9 2.2.7. Caracterización morfoagronómica y molecular 9 2.3. Lulo ( Solanum quitoense, Lam.) 10 2.3.1. Origen y distribución 10 2.3.2. Taxonomía 11 2.3.3. Morfología 11 2.3.4. Variedades 12 2.3.5. Producción Nacional 12 2.3.6. Composición físico-química y uso del fruto 12 2.3.7. Caracterización morfoagronómica y molecular 13 2.4. Marcadores Moleculares 14 2.4.1. Marcadores moleculares COS II 15 2.4.2. Polimorfismos usando la técnica CAPS 17 2.4.3. Polimorfismos SNPs e InDels 18 2.5. Híbridos 18 2.6. Mejoramiento de Plantas 20 2.6.1. Desarrollo de híbridos en tomate de árbol 21 2.6.2. Desarrollo de híbridos en lulo 22 2.6.3. Estudios de identificación de híbridos a nivel molecular 24 2.7. Análisis de variación genética y estructura poblacional 25 3. MATERIALES Y MÉTODOS 27 3.1. Localización 27 3.2. Material vegetal 27 3.3. Extracción de ADN 28 3.4. Selección de marcadores in silico 28 3.5. Amplificación y visualización de marcadores en laboratorio 29 3.6. Análisis estadísticos 30 3.6.1. Análisis de conglomerados 30 3.6.2. Análisis de variación genética, estructura poblacional y PCA 30 3.6.3. Análisis de paternidad 31 3.6.4. Selección de marcadores recomendados para uso en programas de mejoramiento 32 4. RESULTADOS Y DISCUSION 33 4.1. Extracción de ADN y cuantificación 33 4.2. Identificación de marcadores COSII polimórficos 33 4.3. Análisis del híbrido control de lulo 36 4.3.1. Análisis de conglomerados híbrido control 37 4.3.2. Análisis de companentes principales híbrido control 39 4.4. Análisis de híbridos de lulo del C. I. La Selva 40 4.4.1. Análisis de conglomerados y componentes principales padres lulo 41 4.4.2. Análisis de conglomerados y componentes principales híbridos lulo 44 4.4.3. Análisis de madres probables vs. PCA por híbrido 47 4.4.4. Marcadores recomendados para uso inmediato en programas de mejoramiento del C.I. La Selva. 57 4.4.5. Estructura poblacional y heterocigosidad en híbridos de lulo 59 4.5. Identificación de híbridos tomate de árbol 62 4.5.1. Análisis de conglomerados y componentes principales tomate de árbol 63 4.5.2. Análisis padres probables en tomate de árbol 65 4.5.3. Marcadores recomendados para uso inmediato en programas de mejoramiento 66 4.5.4. Análisis estructura poblacional y variabilidad híbridos tomate de árbol 68 4.6. Inferencias generales del estudio 69 5. CONCLUSIONES 72 6. RECOMENDACIONES 73 BIBLIOGRAFIA 74 ANEXOS 81 LISTA DE TABLAS Tabla 1. Composición química, del tomate de árbol 9 Tabla 2. Composición química, del lulo 13 Tabla 3 . Principales marcadores moleculares, utilizados en plantas. 15 Tabla 4. Material vegetal de lulo y tomate de árbol evaluado 27 Tabla 5. Madres más probables en cruces de lulo 48 Tabla 6 . Marcadores recomendados para la identificación de híbridos 1H a 10H 58 Tabla 7. Índices de fijación y heterocigosidad por locus y por accesión de padres, madres híbridos y parentales e híbridos de lulo. 60 Tabla 8. Madres más probables en cruces de tomate de árbol 65 Tabla 9. Marcadores recomendados para identificación de híbridos Tomate de árbol 69 Tabla 10. Índices de fijación y heterocigosidad por locus y por accesión de híbridos tomate de árbol 69 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Diseño de cebadores universales para especies de Euasteride I (UPA) en un grupo COS II 17 Figura 2. Ejemplo de marcadores CAPS 18 Figura 3 . Análisis de madres más probables 31 Figura 4. Visualización calidad del ADN y productos de amplificación por PCR 33 Figura 5. Casos de polimorfismos en el híbrido control 11H. 33 Figura 6. Casos en gel de agarosa para identificación de híbridos lulo 35 Figura 7. Dendograma UPGMA de padres e hijos del cruce control 11H, generado con el Sofware PAUP4b10 y algoritmo UPGMA. 38 Figura 8. Visualización en gel, marcador 2g34470 polimórfico por InDel. 39 Figura 9 . Análisis de componentes principales para híbrido control 11H. 40 Figura 10. Árbol consenso de poblaciones de padres y madres de híbridos de lulo UPGMA 42 Figura 11. Análisis de componentes principales (PCA) para los individuos paternos y maternos de los cruces 1H a 11H 43 Figura 12. Árbol consenso de poblaciones híbridas de lulo utilizando UPGMA. 45 Figura 13. Análisis de componentes principales (PCA) para híbridos 1H a 11H.