Lehrstuhl für Biologische Chemie Forschungsdepartment für Biowissenschaftliche Grundlagen Evolutives Protein-Design eines „Anticalins“ mit Bindungsspezifität für Digoxigenin Dipl.-Ing. Steffen Schlehuber Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigten Dissertation. Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. J. Friedrich Prüfer der Dissertation: 1. Univ.-Prof. Dr. A. Skerra 2. Univ.-Prof. Dr. H. Klostermeyer, emeritiert Die Dissertation wurde am 12.10.2001 bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt am 06.12.2001 angenommen. Die vorliegende Arbeit wurde in der Abteilung Proteinchemie am Institut für Biochemie, Fachbereich Chemie, der Technischen Universität Darmstadt begonnen und am Lehrstuhl für Biologische Chemie im Forschungsdepartment für Biowissenschaftliche Grundlagen am Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Techni- schen Universität München weitergeführt und abgeschlossen. Herrn Prof. Dr. A. Skerra danke ich für die interessante und vielseitige Themenstellung, für zahlreiche inspirierende Diskussionen sowie das stete Interesse am Fortgang und Erfolg meiner Arbeit. Meinen Kolleginnen und Kollegen der Abteilung Proteinchemie und des Lehrstuhls für Biolo- gische Chemie danke ich für ihre Hilfsbereitschaft und das ausgezeichnete Arbeitsklima. Mein besonderer Dank gilt meinem Vorgänger auf dem Arbeitsgebiet der Anticaline, Herrn Dr. Gerald Beste, sowie meinen Kollegen Markus Fiedler und Martin Vogt, die immer Zeit für einen wissenschaftlichen Disput fanden. Für die Durchführung der massenspektrometrischen Analysen danke ich Herrn Dr. F. J. Winkler; Herrn Dr. R. Medina danke ich für die Synthese eines Säulenmaterials. Teile der vorliegenden Dissertation wurden bereits bzw. werden in Kürze durch folgende Veröffentlichungen der Fachwelt zugänglich gemacht: Schlehuber, S., Beste, G. & Skerra, A. (2000) A novel type of receptor protein, based on the lipocalin scaffold, with specificity for digoxigenin. J. Mol. Biol. 297, 1105-1120. Schlehuber, S. & Skerra, A. (2001) Duocalins, engineered ligand-binding proteins with dual specificity derived from the lipocalin fold. Biol. Chem. 382, 1335-1342. Schlehuber, S. & Skerra, A. Tuning ligand affinity, specificity, and folding stability of an engineered lipocalin variant – "anticalin" – using a molecular random approach. Biophys. Chem. accepted for publication. Korndörfer, I. P., Schlehuber, S. & Skerra, A. The crystal structure of the DigA16 anticalin, an engineered digoxigenin binding variant of the bilin-binding protein from Pieris brassicae, shows a new alpha helix. In preparation. Skerra, A. & Schlehuber, S. (1999) „Muteine des Bilin-Bindungsproteins“, Patentschrift DE 199 26 068 C1 (erteilt am 11. Januar 2001). Meiner Familie Inhalt I Inhalt 1 Einleitung ..............................................................................................................................1 1.1 Die Proteinfamilie der Lipocaline ....................................................................................1 1.2 Das Bilin-Bindungsprotein aus Pieris brassicae..............................................................4 1.3 „Anticaline“: Künstliche Bindungsproteine auf der Grundlage der Lipocalin- Architektur........................................................................................................................7 1.4 Das Phagemid-Präsentationssystem und der Kolonie-Filterstapel-Test...........................9 1.5 Die Bibliothek randomisierter BBP-Varianten ..............................................................11 1.6 Der Phasmidvektor für das Phage Display des BBP......................................................15 1.7 Digoxigenin: Anwendungen in der Therapie und als molekularer Marker....................18 1.8 Aufgabenstellung............................................................................................................20 2 Material & Methoden.........................................................................................................21 2.1 Material...........................................................................................................................21 2.1.1 Biologisches Material............................................................................................21 2.1.1 Plasmide ................................................................................................................21 2.1.2 Oligodesoxynukleotide..........................................................................................22 2.1.4 Proteine bzw. Enzyme ...........................................................................................23 2.1.5 Chemikalien...........................................................................................................24 2.1.6 Standards und Kits.................................................................................................27 2.1.7 Geräte ....................................................................................................................28 2.1.8 Sonstiges Material .................................................................................................31 2.1.9 Medien, Antibiotika und allgemeine Lösungen ....................................................33 2.2 Molekularbiologische Methoden....................................................................................40 2.2.1 Kultivierung und Konservierung von E. coli-Stämmen ........................................40 2.2.2 Transformation von E. coli-Stämmen mit Plasmid-DNA .....................................40 2.2.2.1 Transformation nach der CaCl2-Methode .................................................41 2.2.2.2 Transformation mittels Elektroporation ....................................................41 2.2.3 DNA-Isolierung aus E. coli ...................................................................................43 2.2.3.1 Isolierung von Plasmid-DNA ....................................................................43 2.2.3.2 Präparation von Einzelstrang-DNA...........................................................43 2.2.4 Gelelektrophorese von DNA .................................................................................44 2.2.4.1 Analytische Agarose-Gelelektrophorese ...................................................45 2.2.4.2 Präparative Agarose-Gelelektrophorese und Isolierung von DNA- Fragmenten ................................................................................................45 2.2.4.3 Polyacrylamid/Harnstoff-Gelelektrophorese.............................................45 2.2.5 In vitro-Modifizierung von DNA ..........................................................................46 2.2.5.1 5'-Phosphorylierung von Oligodesoxynukleotiden ...................................46 2.2.5.2 Ortsspezifische Mutagenese nach Kunkel.................................................47 II Inhalt 2.2.5.3 Sequenzierung doppelsträngiger DNA ..................................................... 48 2.2.5.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)............................................................ 48 2.2.5.5 Spaltung doppelsträngiger DNA mit Restriktionsendonukleasen ............ 49 2.2.5.6 Dephosphorylierung von DNA ................................................................. 49 2.2.5.7 Entfernung überstehender DNA-Enden ................................................... 50 2.2.5.8 Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung ............................... 50 2.2.5.9 Ligierung von DNA-Fragmenten.............................................................. 51 2.3 Phagemid-Präsentation und -Selektion .......................................................................... 51 2.3.1 Propagation von Helferphagen.............................................................................. 51 2.3.2 Präparation rekombinanter Phagemide ................................................................. 52 2.3.2.1 Produktion von Phagemid-Bibliotheken................................................... 52 2.3.2.2 Amplifizierung selektierter Phagemide .................................................... 54 2.3.3 Affinitätsanreicherung rekombinanter Phagemide ............................................... 54 2.3.3.1 Anreicherung durch Adsorption an funktionalisierte Polystyrolstifte ...... 55 2.3.3.2 Anreicherung durch Adsorption an paramagnetische Partikel ................. 56 2.3.4 Titerbestimmung von Phagemidlösungen............................................................. 57 2.3.5 Kolonie-Filterstapel-Test ...................................................................................... 57 2.4 Funktionelle Produktion rekombinanter Proteine in E. coli .......................................... 59 2.5 Proteinchemische Methoden.......................................................................................... 61 2.5.1 Affinitätschromatographie an Streptavidin-Sepharose ......................................... 61 2.5.2 Metallchelat-Affinitätschromatographie............................................................... 62 2.5.3 Analytische Batch-Chromatographie.................................................................... 62 2.5.4 Gelpermeations-Chromatographie.......................................................................