UNIVERSIDDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÂNICA E INORGÂNICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA KARISIA SOUSA BARROS DE LIMA ESTUDO FITOQUÍMICO DE DUAS ESPÉCIES DE Hyptis DO NORDESTE DO BRASIL: Hypptis carvalhoi Harley e Hyptis crassifolia Mart. ex Benth. E ATIVIDADE ANTICÂNCER DOS COMPOSTOS ISOLADOS FORTALEZA 2014 KARISIA SOUSA BARROS DE LIMA ESTUDO FITOQUÍMICO DE DUAS ESPÉCIES DE Hyptis DO NORDESTE DO BRASIL: Hyptis carvalhoi Harley e Hyptis crassifolia Mart. ex Benth. E ATIVIDADE ANTICÂNCER DOS COMPOSTOS ISOLADOS Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-graduação em Química do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do Título de Doutor em Química. Área de concentração: Química Orgânica. Orientador: Prof. Edilberto Rocha Silveira FORTALEZA 2014 KARISIA SOUSA BARROS DE LIMA ESTUDO FITOQUÍMICO DE DUAS ESPÉCIES DE Hyptis DO NORDESTE DO BRASIL: Hypyptis carvalhoi Harley e Hyptis crassifolia Mart. ex Benth E ATIVIDADE ANTICÂNCER DOS COMPOSTOS ISOLADOS Tese submetida à Coorrddenação do Programa de Pós-graduação em Química do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da Universiddade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do Título de Doutor emm Química. Área de concentração: Química Orgânica. Aprovada em 28/08/2014 BANCA EXAMINADORA À Deus. Aos meus pais Ao meu esposo, Welton. AGRADECIMENTOS À Deus, por tudo que Ele tem proporcionado em minha vida. Aos meus Pais, Miguel Romelio Barros de Lima (in memoriam) e Maria Nomésia Sousa de Lima e minha tia-mãe, Rosa Lopes de Souza, pela dedicação, pelo apoio, pela atenção, pelo carinho e principalmente pelos ensinamentos sempre coerentes e indispensáveis à minha vida. Ao meu marido, Welton de Souza Silva, pelo seu companheirismo, carinho, atenção e pelo auxílio em todos os momentos de confecção deste trabalho. Aos meus irmãos, Fabricio Sousa Barros de Lima e Michel Sousa Barros de Lima, que mesmo distantes puderam contribuir com a motivação e o apoio. Ao meu orientador, Prof. Edilberto Rocha Silveira, pela acolhida, dedicação, amizade, atenção e conhecimento transmitido para o desenvolvimento deste trabalho e principalmente, por todas as críticas e sugestões que foram essenciais para o meu crescimento pessoal e profissional e para o aprimoramento desta tese. À minha colaboradora e amiga, Profa. Renata Mendonça Araújo, pelo grande incentivo, colaboração, orientação, dedicação e amizade e também por ter me acolhido em seu laboratório na UFRN. À botânica Profa. Maria Lenise Silva Guedes, do Instituto de Biologia do Departamento de Botânica da Universidade Federal da Bahia, pela identificação botânica das espécies estudadas. À Profa. Letícia Veras Costa-Lotufo do Departamento de Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, pela realização das atividades citotóxicas, principalmente a aluna Ana Jérsia Araújo do Laboratório de Oncologia Experimental-UFC pelo comprometimento com as análises farmacológicas. A todos os professores do curso de Pós-Graduação em Química, pelos conhecimentos transmitidos. A todos os meus colegas de bancada do LAFIPLAM I e II, pelo apoio constante e convivência sempre alegre e divertida. Aos meus amigos de sempre, em especial a minha amiga irmã Thiciana da Silva Souza, por tudo que eles representam na minha vida, pelos incentivos e momentos de descontração. As minhas amigas e companheiras Patrícia Coelho do Nascimento e Nayara Coriolano, por todos os momentos que passamos juntas, apoiando e incentivando umas às outras. Aos colegas de turma, pelas reflexões, críticas e sugestões recebidas. Aos funcionários do departamento pelos serviços prestados. Ao CNPq pela bolsa de doutorado. Ao CNPq, CAPES, FUNCAP, PRONEX, pelo apoio financeiro. A todos que direta ou indiretamente auxiliaram na conclusão deste trabalho. RESUMO Este trabalho descreve a investigação fitoquímica de dois espécimes de Hyptis: H. carvalhoi Harley e H. crassifolia Mart. ex Benth. O objetivo é investigar plantas do gênero Hyptis do Nordeste do Brasil, na busca por compostos bioativos, principalmente com atividade anticâncer. A prospecção química relativa às duas espécies resultou no isolamento de 10 substâncias para H. crassifolia e 12 substâncias para H. carvalhoi. Do extrato etanólico das raízes de H. crassifolia foram isolados nove diterpenos e o triterpeno conhecido como ácido betulínico. Dos nove diterpenos, quatro são abietanos: 12-hidroxi-8,11,13-abietatrieno, 12- hidroxi-8,11,13-abietatrien-7-ona, 11,12,15-tri-hidroxi-8,11,13-abietatrien-7-ona e 6α,11,12,15-tetra-hidroxi-8,11,13-abietatrien-7-ona, dos quais a 11,12,15-tri-hidroxi-8,11,13- abietatrien-7-ona está sendo relatada pela primeira vez como um novo diterpeno abietano natural e a 6α,11,12,15-tetra-hidroxi-8,11,13-abietatrien-7-ona é inédita na literatura. Três apresentam esqueletos abietanos rearranjados: 11,12,14,16-tetra-hidroxi-17 15 16 -abeo- abieta-8,11,13-trien-7-ona, 11,12,16-tri-hidroxi-17 15 16-abeo-abieta-8,11,13-trien-7-ona e (16S)-12,16-epoxi-11,14-di-hidroxi-1715 16-abeo-abieta-8,11,13-trien-7-ona, sendo a 11,12,16-tri-hidroxi-1715 16 -abeo-abieta-8,11,13-trien-7-ona inédita, e para a (16S)- 12,16-epoxi-11,14-di-hidroxi-1715 16 -abeo-abieta-8,11,13-trien-7-ona está se propondo uma revisão dos dados de RMN de 1H e 13C relatados na literatura. Foram isolados também dois diterpenos labdanos conhecidos: óxido de 11β-hidroximanoila e óxido de 11- oxomanoila. Do extrato hexânico das raízes de H. carvalhoi foram isolados dez diterpenos, uma substância de biossíntese mista, denominada de 3β-[4’-acetoxiangeloiloxi]-tremetona, ainda não relatada na família Lamiaceae e o ácido betulínico, marcador quimiotaxonômico no gênero Hyptis. Dos dez diterpenos, cinco são abietanos: 12-hidroxi-8,11,13-abietatrien-20-al, 8,11,13-abietatrien-12,20-diol, ácido 11-hidroxi-12-metoxi-8,11,13-abietatrien-10-óico, ácido 12-hidroxi-8,11,13-abietatrien-10-óico e 12-hidroxi-8,11,13-abietatrieno, um nor-diterpeno, com esqueleto 20-nor-icetexano inédito, denominado 8(7),10(7)-diepoxi-12-hidroxi-20-nor- 8,11,13-abietatrieno, um diterpeno pimarano, o 11-cetosandaracopimar-15-en-8β-ol, inédito na família Lamiaceae e três tanshinonas: 7β-hidroxi-11,14-dioxoabieta-8,13-dieno, 7,12-di- hidroxi-8,12-abietadien-11,14-di-oxo-20-al e 7α-hidroxi-11,14-dioxoabieta-8,13-dieno, sendo a última inédita na literatura. Todos os compostos foram isolados utilizando sucessivos fracionamentos cromatográficos, incluindo CLAE e a determinação estrutural foi realizada através de técnicas espectroscópicas como EMAR, IV, RMN de 1H e 13C, incluindo sequências de pulsos uni e bidimensionais, e comparação com dados descritos na literatura. Dentre os compostos isolados, dezoito foram testados com relação a inibição do crescimento celular de quatro linhagens de células humanas cancerígenas e dez mostraram atividade. Dos compostos isolados de H. crassifolia o 12-hidroxi-8,11,13-abietatrieno e a 11,12,14,16-tetra- hidroxi-1715 16 -abeo-abieta-8,11,13-trien-7-ona apresentaram atividade citotóxica moderada, enquanto a 12-hidroxi-8,11,13-abietatrien-7-ona apresentou uma atividade citotóxica moderada, porém seletiva contra células tumorais leucêmicas. Dos compostos isolados de H. carvalhoi todos os diterpenos apresentaram atividade citotóxica, mas a 7,12-di- hidroxi-8,12-abietadien-11,14-di-oxo-20-al, após 72 horas de incubação, apresentou valores de CI50 que variaram de 3,91 a 32,01 μM em células tumorais de cólon (HCT-116) e leucêmicas (HL-60), respectivamente. O seu possível mecanismo de ação, foi então estudado. Palavras-chave: Hyptis crassifolia. Hyptis carvalhoi. Diterpenos abietanos. Atividade anticâncer. ABSTRACT This work describes the phytochemical investigation of two specimens of Hyptis: H. carvalhoi Harley and H. crassifolia Mart. ex Benth., whose purpose is to investigate northeastern Brazil plants of the Hyptis genus, in the search for bioactive compounds, especially with anticancer activity. The chemical analysis of both species resulted in the isolation and characterization of 10 substances for H. crassifolia and 12 substances for H. carvalhoi. Of the ethanol extract from roots of H. crassifolia were isolated nine diterpenes and the known triterpene betulinic acid. Of the nine diterpenes, four are abietanes: 12- hydroxy-8,11,13-abietatriene, 12-hydroxy-8,11,13-abietatrie-7-one, 11,12,15-tri-hydroxy- 8,11,13-abietatrien-7-one and 6α,11,12,15-tetra-hydroxy-8,11,13-abietatrien-7-one, from which 11,12,15-tri-hydroxy-8,11,13-abietatrien-7-one is being reported for the first time in the literature as a new natural abietane diterpene and the 6α,11,12,15-tetra-hydroxy-8,11,13- abietatrien-7-one is unknow. Three have rearranged abietanes skeletons: 11,12,14,16-tetra- hydroxy-17 15 16 -abeo-abieta-8,11,13-trien-7-one, 11,12,16-tri-hydroxy-17 15 16 - abeo-abieta-8,11,13-trien-7-one and (16S)-12,16-epoxy-11,14-di-hydroxy-17 15 16 -abeo- abieta-8,11,13-trien-7-one, from which the 11,12,16-tri-hydroxy-1715 16 -abeo-abieta- 8,11,13-trien-7-one is unknown, and to the (16S)-12,16-epoxy-11,14-di-hydroxy-17 15 16 -abeo-abieta-8,11,13-trien-7-one is proposed a revision of the 1H and 13C NMR data previously reported in the literature. Two known labdane diterpenes: 11-oxomanoyl oxide and 11β-hydroxymanoyl oxide were also isolated. From the hexane extract of the roots of H. carvalhoi were isolated ten diterpenes, one compound from a mixed biosynthesis, 3β-[4’- acetoxyangeloiloxy]-tremetone, not yet reported for the Lamiaceae, and betulinic acid, a chemotaxonomic marker for the genus Hyptis. Of the ten diterpenes, five are abietane: 12- hydroxy-8,11,13-abietatrien-20-al, 8,11,13-abietatrien-12,20-diol, 11-hydroxy-12-metoxy- 8,11,13-abietatrien-10-oic acid, 12-hydroxy-8,11,13-abietatrien-10-oic acid and 12-hydroxy- 8,11,13-abietatriene, an unknown nor-diterpene, with a 20-nor-icetexane skeleton identified as 8(7),10(7)-di-epoxy-12-hydroxy-20-nor-8,11,13-abietatriene, a pimarane diterpene, 11- ketosandaracopimar-15-en-8β-ol, unknow in the Lamiaceae and three tanshinones: 7β- hydroxy-11,14-di-oxoabieta-8,13-diene, 7,12-di-hydroxy-8,12-abietadien-11,14-di-oxo-20-al and 7α-hydroxy-11,14-dioxoabieta-8,13-diene, from which the last is unknown.