Untersuchungen zur Regulation des Lipid- und Energiestoffwechsels durch den Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptor α Habilitationsschrift zur Erlangung des akademischen Grades Dr. rer. nat. habil. vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät III der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Frau Dr. rer. nat. Bettina König geb. am: 15. August 1969 in: Halle (Saale) Gutachter/in: 1. Prof. Dr. Gabriele Stangl, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg 2. Prof. Dr. Gerald Rimbach, Christian-Albrechts-Universität zu Kiel 3. Prof. Dr. Uwe Wenzel, Justus-Liebig-Universität Gießen Datum der Verteidigung der Habilitationsschrift: 25.10.2010 Datum der Probevorlesung: 06.12.2010 Halle (Saale), Dezember 2009 Für meine Kinder, das beste Experiment meines Lebens Inhaltsverzeichnis Seite 1 Einführung und Fragestellung 1 2 Eigene Originalarbeiten 6 3 Zusammenfassende Diskussion 144 3.1 Beeinflussung des SREBP-abhängigen Lipidstoffwechsels durch 144 PPARα 3.1.1 PPARα-abhängige Regulation von Insig 144 3.1.2 Natürliche PPARα-Agonisten und speziesspezifische Unterschiede 148 3.1.2.1 Untersuchungen beim Schwein und in HepG2-Zellen 148 3.1.2.2 Untersuchungen bei Legehennen 152 3.2 Regulation der Anpassung an Hunger durch PPARα 157 3.2.1 Regulation der CACT 157 3.2.2 Regulation des Carnitinstoffwechsels 159 3.2.3 Regulation des MCT1 162 3.2.4 Rolle des PPARα im Gehirn 166 4 Zusammenfassung 169 5 Literaturverzeichnis 172 i Abkürzungsverzeichnis BBD γ-Butyrobetain-Dioxygenase CACT Carnitin-Acylcarnitin-Translokase CLA konjugierte Linolsäuren CPT Carnitin-Palmitoyltransferase FAS Fettsäuresynthase FGF fibroblast growth factor HMG 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl 13-HPODE 13-Hydroperoxy-9,11-Octadecadiensäure Insig insulin-induced gene LDL low density lipoprotein LH Luteinisierendes Hormon LXR liver X receptor m mitochondrial MCT Monocarboxylat-Transporter OCTN novel organic cation transporter PPAR Peroxisomenproliferator-aktivierter Rezeptor PPRE PPAR response element PUFA mehrfach ungesättigte Fettsäuren RXR Retinsäurerezeptor SREBP sterol regulatory element–binding protein TML Trimethyllysin TSH Thyreoidea-stimulierendes Hormon VLDL very low density lipoprotein ii 1 Einführung und Fragestellung 1 Einführung und Fragestellung Eine effiziente Bereitstellung von Energie ist Voraussetzung für das Überleben aller Organismen. Hierbei spielt die Fähigkeit, Energieressourcen entsprechend Angebot und Nachfrage zu speichern oder zu mobilisieren, eine fundamentale Rolle. Glukose und langkettige Fettsäuren aus der Nahrung stellen die Hauptenergiequellen für Säuger dar. So haben sich im Laufe der Zeit komplex regulierte Systeme für die Speicherung und Mobilisierung dieser natürlichen Energiequellen entwickelt [1]. Dabei liefern Fettsäuren und andere Nahrungskomponenten nicht nur Energie, sondern lösen auch eine Vielzahl zellulärer Signale aus, unter anderem durch die Beeinflussung der Transkription von Genen [2-5]. Die Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) stellen dabei einen bedeutenden Mediator der Regulation der Genexpression durch Fettsäuren dar [6, 7]. Sie wurden ursprünglich 1990 [8] als nukleare Rezeptoren für Peroxisomenproliferatoren, zu denen die lipidsenkenden Fibrate und auch Weichmacher zählen [9], beschrieben. Kurze Zeit später konnte gezeigt werden, dass verschiedene Fettsäuren, Fettsäurederivate und Eicosanoide ebenfalls als Liganden und Aktivatoren der PPAR wirken und somit ihre physiologischen Agonisten darstellen [6, 10, 11]. Bisher sind die drei PPAR-Subtypen α, β/δ und γ bekannt, die von separaten Genen kodiert werden und sich hinsichtlich Gewebeverteilung und Ligandenbindung unterscheiden [12]. Die transkriptionelle Aktivierung von Genen durch PPAR erfolgt im Heterodimerkomplex mit dem Retinsäurerezeptor (RXR) durch Bindung an spezifische DNA-Sequenzen, die PPAR response elements (PPRE) [13, 14], und wird durch verschiedene Co-Repressoren und Co-Aktivatoren reguliert [15, 16]. Umfangreiche Untersuchungen zu Struktur, Funktion und Wirkungsweise der PPAR zeigten ihre zentrale Beteiligung an der Regulation von Lipid- und Lipoproteinstoffwechsel, Glukosehomöostase, Energiehaushalt, zellulärer Differenzierung und inflammatorischen Prozessen und verdeutlichen somit ihr therapeutisches Potential und ihre Schlüsselstellung in der Therapie von z. B. Fettstoffwechselstörungen oder Diabetes mellitus [17-24]. Fibrate, die bereits seit etwa 40 Jahren zur Therapie von Fettstoffwechselstörungen eingesetzt werden, bewirken über eine Aktivierung des PPARα eine Verringerung der Konzentration an zirkulierenden Triglyzeriden und eine Erhöhung der Konzentration an HDL- Cholesterol. Die triglyzeridsenkende Wirkung wird dabei durch die transkriptionelle Modulation der Lipolyse von triglyzeridreichen Lipoproteinen, der zellulären Aufnahme und β- Oxidation von Fettsäuren sowie eine verringerte Synthese von Fettsäuren und Triglyzeriden erreicht [25]. Dabei sind die Mechanismen, die zur verringerten Synthese von Fettsäuren und Triglyzeriden führen, teilweise noch unklar. Neben der triglyzeridsenkenden Wirkung wurde sowohl für Fibrate als auch natürliche PPARα-Agonisten eine Senkung der Cholesterol- 1 1 Einführung und Fragestellung Konzentrationen in Leber und Plasma von Menschen und Säugern beobachtet, deren molekulare Ursachen bisher ebenfalls weitgehend unbekannt sind [26-29]. Die zentrale Bedeutung des PPARα im Stoffwechsel besteht in seiner Funktion als Sensor für die Konzentration an freien Fettsäuren in der Zelle. So führen freie Fettsäuren, die infolge von Energiemangelzuständen wie z. B. Hunger aus dem Fettgewebe freigesetzt werden, zur Aktivierung des PPARα in der Leber, welcher durch die transkriptionelle Regulation einer Vielzahl von Genen den Säugerorganismus an diese Mangelsituation anpasst [23]. Die kritische Rolle des PPARα im Hungerzustand konnte mit Hilfe von PPARα-defizienten (knockout) Mäusen gezeigt werden, die im Fastenzustand u. a. eine schwere Hypoglykämie und eine Fettleber entwickeln [30-32]. Gesteuert durch PPARα werden im Hungerzustand langkettige Fettsäuren aus dem Fettgewebe in den Mitochondrien zur Energiebereitstellung oxidiert. Dies erfordert den Transport der Fettsäuren über Plasmamembranen, ihre Bindung im Zytosol und den Transport in die Mitochondrienmatrix in Form von Carnitin-Derivaten. Für eine Vielzahl von Enzymen und Proteinen, die maßgeblich an diesen komplexen Mechanismen und der nachfolgenden β-Oxidation beteiligt sind, konnte eine transkriptionelle Regulation der kodierenden Gene durch PPARα bereits gezeigt werden [23]. So weisen sowohl die Acyl-CoA-Synthase als auch die Carnitin-Palmitoyltransferase (CPT)-I, welche die Umwandlung der Fettsäuren in die entsprechenden Carnitin-Derivate katalysieren, funktionelle PPRE in ihren Promotorregionen auf [33-35]. Ob auch der nachfolgende Transport des Acylcarnitins in die mitochondriale Matrix, der durch die Carnitin-Acylcarnitin- Translokase (CACT) vermittelt wird, einer Regulation durch PPARα unterliegt, ist nahe liegend, wurde bisher jedoch nicht untersucht. Aufgrund seiner Rolle beim Transport der langkettigen Fettsäuren in die mitochondriale Matrix stellt Carnitin einen essenziellen Metabolit für die β-Oxidation von Fettsäuren dar [36- 38]. Alle Gewebe, die Fettsäuren als Energiequelle nutzen, benötigen Carnitin für ihre normale Funktion. Carnitin steht dem Körper zum einen aus der Nahrung, zum anderen aus der körpereigenen Biosynthese, die hauptsächlich in der Leber stattfindet, zur Verfügung [39]. Gewebe, die nicht zur Biosynthese befähigt sind, müssen Carnitin aus dem Blut aufnehmen. Die Verteilung des Carnitins im Körper und die intrazelluläre Carnitin- Homöostase werden durch spezifische Membrantransporter, die novel organic cation transporters (OCTN) kontrolliert, die in der apikalen Zellmembran lokalisiert sind [40, 41]. Interessanterweise wurden in den Lebern von Ratten, die gefastet oder mit dem synthetischen PPARα-Agonisten Clofibrat behandelt wurden, erhöhte Carnitin- konzentrationen gefunden [42-45], was eine Rolle des PPARα in der Regulation der Carnitinhomöostase vermuten lässt. Inwiefern diese erhöhten Carnitinkonzentrationen in der Leber von Ratten bei Nahrungsentzug bzw. nach Clofibratbehandlung tatsächlich durch eine 2 1 Einführung und Fragestellung Beeinflussung der Carnitinaufnahme und/oder der Carnitin-Biosynthese durch PPARα zustande kommen, ist bislang unbekannt. Das aus der β-Oxidation der langkettigen Fettsäuren stammende Acetyl-CoA wird unter anderem zur Synthese von Ketonkörpern verwendet, die im Hungerzustand eine bedeutende Energiequelle darstellen. Der damit normalerweise einhergehende Anstieg der Konzentration an zirkulierenden Ketonkörpern im Plasma konnte bei PPARα-defizienten Mäusen nicht oder kaum beobachtet werden [30-32]. Ursächlich hierfür ist die fehlende Induktion der mitochondrialen 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-(mHMG)-CoA-Synthase [32], dem Schlüssel- enzym der Ketonkörpersynthese, welches ebenfalls über ein PPRE im Promotor durch PPARα reguliert wird [46, 47]. Nach ihrer Synthese in der Leber werden die Ketonkörper in die peripheren Gewebe transportiert und dort oxidiert. Der Transport der Ketonkörper über Membranen wird durch die Familie der Monocarboxylat-Transporter (MCT) bewerkstelligt, die zur Genfamilie der solute carrier-16 gehören [48-51]. Der bisher am umfangreichsten charakterisierte Vertreter MCT1 wird ubiquitär exprimiert und transportiert neben Ketonkörpern auch Laktat, Pyruvat und Butyrat [48]. Die funktionelle Assoziation des MCT1 mit der Ketogenese und seine Rolle in der Energieversorgung