Anwendung der Mikroarray-Technologie für eine globale Charakterisierung der Spermatogenese des Menschen und seiner Pathologien Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften im Fachbereich Chemie der Universität Hamburg vorgelegt von CAROLINE FEIG Hamburg 2007 Die vorliegende Arbeit wurde in der Abteilung für Andrologie des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf durchgeführt. 1. Dissertationsgutachter: Herr Prof. Dr. Ulrich Hahn Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie Martin-Luther-King-Platz 6 20146 Hamburg 2. Dissertationsgutachterin: Frau Prof. Dr. Christiane Kirchhoff Abteilung für Andrologie Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Martinistrasse 52 20246 Hamburg Tag der Disputation: 11. Mai 2007 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis ................................................................................................ I Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................... V 1 Einleitung ............................................................................................................ 1 1.1 Das Problem der männlichen Infertilität................................................................. 1 1.2 Die Organisation des Hodens.................................................................................. 3 1.3 Die Spermatogenese................................................................................................ 4 1.3.1 Phasen der Spermatogenese .................................................................................... 4 1.3.2 Synchronisation der spermatogenetischen Stadien ................................................. 6 1.4 Hormonelle Kontrolle der Spermatogenese............................................................ 8 1.5 Genexpression im Testis ......................................................................................... 9 1.6 Mikroarray-Technologie ...................................................................................... 12 1.6.1 Das Prinzip............................................................................................................ 12 1.6.2 Verschiedene Mikroarray-Plattformen.................................................................. 14 1.6.2.1 Aufbau und Herstellung der Affymetrix GeneChips ® .......................................... 14 1.6.2.2 Aufbau und Herstellung der CodeLink Bioarrays ................................................ 17 1.6.3 Die Mikroarray-Technologie in der Untersuchung multifaktorieller Krankheiten ........................................................................................................... 18 1.6.4 Klassifizierung unterschiedlicher Testispathologien als eine notwendige Voraussetzung für globale Genexpressionsstudien............................................... 20 1.7 Zielsetzung der Arbeit........................................................................................... 23 2 Material und Methoden .................................................................... 25 2.1 Material ................................................................................................................. 25 2.1.1 Chemikalien .......................................................................................................... 25 2.1.2 Verbrauchsmaterialien .......................................................................................... 26 2.1.3 Geräte .................................................................................................................... 26 2.1.4 Software und Internetadressen .............................................................................. 27 2.1.5 Reaktions-Kits ....................................................................................................... 28 2.1.6 Puffer und Lösungen............................................................................................. 28 2.1.6.1 Allgemeine Lösungen ........................................................................................... 28 2.1.6.2 Für Mikroarray-Experimente verwendete Lösungen ............................................ 29 2.1.6.2.1 Affymetrix-Plattform ............................................................................................ 29 2.1.6.2.2 CodeLink-Plattform .............................................................................................. 30 Inhaltsverzeichnis II 2.1.7 Molekulargewichtsmarker..................................................................................... 30 2.1.8 Oligonukleotide..................................................................................................... 30 2.1.8.1 Primer für Referenzgene ....................................................................................... 31 2.1.8.2 Primer für die Mikroarray-Validierung ausgewählter Gene ................................. 31 2.1.9 Humanes Gewebematerial..................................................................................... 33 2.2 Methoden............................................................................................................... 33 2.2.1 Molekularbiologische Methoden........................................................................... 33 2.2.1.1 Isolierung von Gesamt-RNA aus humanen Gewebeproben ................................. 33 2.2.1.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung......................................................... 34 2.2.1.2.1 Photometer Ultrospec 3000................................................................................... 34 2.2.1.2.2 NanoDrop ND-1000-Spektrophotometer.............................................................. 34 2.2.1.3 Agarose-GITC-Gelelektrophorese zur Überprüfung von Gesamt-........................... RNA-Extraktion .................................................................................................... 34 2.2.1.4 Bioanalyzer-Messung............................................................................................ 35 2.2.1.5 cDNA-Synthese..................................................................................................... 36 2.2.1.6 Real-time RT-PCR mit dem LightCycler TM .......................................................... 36 2.2.2 Mikroarray-Analyse .............................................................................................. 40 2.2.2.1 Genereller Ablauf eines Mikroarray-Experimentes .............................................. 40 2.2.2.2 Allgemeine Informationen zur Auswertung von Mikroarray-Daten..................... 41 2.2.2.3 Affymetrix-Plattform (Santa Clara, USA) ............................................................ 43 2.2.2.3.1 cRNA-Herstellung................................................................................................. 43 2.2.2.3.2 Hybridisierung und Waschen der Mikroarrays ..................................................... 44 2.2.2.3.3 Scannen der Mikroarrays ...................................................................................... 45 2.2.2.3.4 Qualitätskontrolle.................................................................................................. 46 2.2.2.3.5 Normalisierung der Daten und Hintergrundfilterung............................................ 46 2.2.2.3.6 Identifizierung differentiell exprimierter Gene ..................................................... 47 2.2.2.3.7 Clusteranalyse der Proben..................................................................................... 47 2.2.2.3.8 Clustering von Genen mit ähnlichen Expressionsprofilen.................................... 48 2.2.2.3.9 Funktionelle Annotierung der PAM-Cluster......................................................... 49 2.2.2.4 CodeLink-System (GE Healthcare, Piscataway, NJ)............................................ 50 2.2.2.4.1 cRNA-Herstellung................................................................................................. 50 2.2.2.4.2 Hybridisierung und Waschen der Mikroarrays ..................................................... 50 2.2.2.4.3 Scannen der Mikroarrays ...................................................................................... 51 2.2.2.4.4 Hintergrundfilterung und Normalisierung der Daten............................................ 51 Inhaltsverzeichnis III 2.2.2.4.5 Identifizierung differentiell exprimierter Gene ..................................................... 52 2.2.2.4.6 Clusteranalyse der Proben..................................................................................... 52 2.2.2.4.7 Clustering von Genen mit ähnlichen Expressionsprofilen.................................... 52 3 Ergebnisse .......................................................................................... 54 3.1 Etablierung eines „molekularen Archivs“ individueller humaner Testisbiopsien........................................................................................................ 54 3.1.1 Einführung............................................................................................................. 54 3.1.2 RNA-Qualität ........................................................................................................ 54 3.2 Auswahl geeigneter Biopsien für die globale Genexpressionsanalyse des humanen Testis...................................................................................................... 59 3.3 Verteilungsmuster der spermatogenetischen Aktivität im Testis.......................... 64 3.4 Qualitätskontrolle der Arrays vor der Normalisierung.........................................