DIVERSIDAD DE LYCASTE SKINNERI (BATEM EX. LINDL.) LINDL. EN GUATEMALA: ANÁLISIS DE GERMOPLASMA PARA SU CONSERVACIÓN. FODECYT 59-00 Marzo 2003 TITULO DE PROYECTO: DIVERSIDAD DE LYCASTE SKINNERI (BATEM. EX LINDL.) LINDL. EN GUATEMALA: ANÁLISIS DE GERMOPLASMA PARA SU CONSERVACIÓN. FINANCIADO POR: SENACYT LÍNEA DE FINANCIAMIENTO: FODECYT NUMERO DE PROYECTO: 59-00 INSTITUCIÓN EJECUTORA: UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA INVESTIGADOR PRINCIPAL: GERDA MARIA HUERTAS DE ORDÓÑEZ INVESTIGADOR ASOCIADO: MAYRA MALDONADO INVESTIGADOR ASOCIADO: MARGARET ANN DIX INVESTIGADOR ASOCIADO: MICHAEL WILLIAM DIX TÉCNICO REPRODUCCIÓN IN VITRO: LISBETH PANIAGUA TÉCNICO ANÁLISIS GENÉTICO: LUIS CARLOS CASTELLANOS FECHA DE INICIO: 03 DE SEPTIEMBRE 2001 FECHA FINAL: 28 DE FEBRERO 2003 Índice Temático Contenido Pag. AGRADECIMIENTOS v I. INTRODUCCIÓN 1 II. ANTECEDENTES 1 A. Análisis Morfométrico 4 B. Análisis Genético 5 C. Cultivo de Tejidos in vitro 11 III. OBJETIVOS 15 IV. HIPÓTESIS 15 V. METODOLOGÍA 16 A. Fuente de Muestreo 16 B. Análisis Morfométrico 16 C. Análisis Genético 18 1. Extracción de ADN 18 2. Cuantificación de ADN por fluorimetría 18 3. Amplificación de ADN por medio de la Reacción en Cadena de la 19 Polimerasa (PCR) 4. Técnicas de “Touchdown” para la amplificación de ADN por 21 medio de PCR 5. Electroforesis en Agarosa 22 6. Visualización en Gel de Agarosa 23 D. Cultivo de Tejidos in vitro 23 1. Selección de Tejidos 23 2. Desinfección de muestras 24 3. Siembra in vitro 24 VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 25 A. Fuente de muestreo 25 B. Análisis Morfométrico 25 C. Análisis Genético 31 1. Extracción de ADN 31 2. Cuantificación de ADN por Fluorimetría 31 3. Visualización de ADN en gel de Agarosa 32 D. Cultivo de Tejidos in vitro 39 ii Índice Temático (continuación) Contenido Pag. VII. CONCLUSIONES 41 VIII. RECOMENDACIONES 42 IX.BIBLIOGRAFÍA 44 ANEXOS 47 ANEXO A. SOLUCIONES MADRE ANÁLISIS GENÉTICO 48 ANEXO B. MEDIOS DE CULTIVO IN VITRO 49 ANEXO C. INFORME FINANCIERO 54 iii Índice de Cuadros Contenido Pag. Cuadro 1. Comparación de los tres genomas en la célula vegetal (Judd et al., 5 1999) Cuadro 2. Datos continuos medidos (en mm) y proporciones basadas en 16 estas mediciones de partes florales de Lycaste skinneri Cuadro 3. Estadígrafos que describen las partes florales de Lycaste skinneri 28 (n=110). Cuadro 4. Análisis de componentes principales de las características florales 30 de Lycaste skinneri Cuadro 5. Cantidades de ADN cuantificado (ng/ml) de las extracciones 32 realizas de hojas de orquídeas del género Lycaste Cuadro 6. Cantidad de muestras amplificadas y visualizadas en agarosa, 32 clasificadas por gen analizado, incluye extracciones en triplicado Cuadro 7. Cantidad de muestras de ADN amplificadas y visualizadas en 33 agarosa, por experimento, bajo distintas condiciones. Cuadro 8. Cantidad de muestras sembradas en los diferentes medios 40 iv Índice de Figuras Contenido Pag. Figura 1. Distribución histórica de Lycaste skinneri en Guatemala 3 (Modificado de Chavaría Samayoa, 1982). Figura 2. Localización de genes en el ADN cloroplásmico de Oryza sativa L. 6 (Hiratsuka et al., 1989). Figura 3. Diagramas de la localización de los cebadores en las regiones 10 amplificadas. (Tomados de Neyland y Urbasch, 1995; Johnson y Soltis, 1995; modificado de Bodo Slotta, 2000; y Saar Polans, 2000) A. Gen de la subunidad F de la NADH deshidrogenasa; B. Gen de la subunidad K de las madurasas C. Epaciador Interno Transcrito de unidad del ADN ribosomal en el núcleo. Figura 4. Partes florales, mostradas en Lycaste skinneri var. rosea (en 17 cultivo). Figura 5. Localidades historicas de Lycaste skinneri comparadas con 26 localidades de germoplasma disponible y no disponible para el año 2001-2002 en Guatemala Figura 6. Variabilidad de Coloración y Forma del Labio de Lycaste skinneri 27 de Guatemala Figura 7. Cladograma que agrupa las localidades de las flores medidas de 31 Lycaste skinneri en base a sus características morfométricas. Figura 8. Amplificación del gen ITS-1 en muestras de orquídeas del género 34 Lycaste (2-9). Figura 9. Amplificación del gen ITS-1 e ITS-2 en muestras de Solanum sp 35 (1-5). Figura 10. Amplificación del gen ITS-1 e ITS-2 en muestras de Lycaste del 35 Sección Xanthanthae Figura 11. Amplificación del gen ITS-1 en muestras de Lycaste skinneri var. 36 rosea en cultivo en Baja Verapaz (2-11) Figura 12. Amplificación del gen ITS-2 en muestras de Lycaste skinneri var. 36 rosea en cultivo de Baja Verapaz (2-11). Figura 13. Metodología de PCR touchdown con tres distintas muestras de 38 Lycaste skinneri var. rosea (1, 2, 3) utilizado 3 cebadores (A=matK, B=ITS-1 y C=ITS-2) Figura 14. Producto esperado de seis muestras de Lycaste de la sección 38 Xanthanthae utilizando cebadores para el gen matK realizado en el año 2000 (datos no publicados) Figura 15. Partes de plantas de Lycaste vivas y muertas en los diferentes 40 medios de cultivo v AGRADECIMIENTOS A la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología por el financiamiento otorgado (Proyecto FODECYT 59-00) y la ayuda y orientación a través del apoyo prestado por el personal de la línea FODECYT. A los integrantes de la Asociación Guatemalteca de Orquídeologia (AGO) y a los de la Asociación Verapacense de Orquideología por proporcionarnos muestras de flores y hojas de sus plantas, en especial a Regina Lizama, Regina de Castejón, Mario Palmieri y Silvia de Palmieri. A los Drs. Dix por su asesoría durante el proceso, y apoyo en viajes de campo y muestras de sus plantas cultivadas. A la Licenciada Margarita Palmieri por su asesoría en el cultivo de tejidos y uso de espacio en el laboratorio de cultivo de tejidos. Al Dr. Paul Manos de la Universidad de Duke, Carolina del Norte (EE.UU.) por su asesoría en el análisis genético y obsequio de cebadores ITS. 1 I. INTRODUCCIÓN En el campo de la horticultura las especies del género Lycaste son muy cotizadas porque sus híbridos con otras especies son muy vistosos y de variados colores. Por esta razón y el avance de la frontera agrícola, las plantas en el campo casi han desaparecido en su totalidad, y han sufrido erosión genética porque pocos fenotipos son apreciados por los horticultores. La mayoría de plantas de la especie Lycaste skinneri, cuya variedad alba es la flor nacional de Guatemala, se pueden encontrar en colecciones privadas y muy pocas veces en su hábitat natural. Se realizaron análisis morfométricos de flores y análisis genéticos de la porción matK y ndhF en ADN cloroplásmico y de la porción ITS1 e ITS2 de los ribosomas nucleares para tratar de determinar la procedencia genética de Lycaste skinneri, además se evaluó el crecimiento in vitro de diferentes porciones de la planta y sus semillas en 8 medios diferentes. El análisis morfométrico muestra 8 grupos de caracteres medidos que presentan mayor varianza y sirven para poder agrupar los diferentes tamaños de las flores de las plantas dentro de Lycaste skinneri. Estos datos muestran una tendencia de aumentar el tamaño de la flor desde las poblaciones en el Sur hacia el área de las Verapaces. No hay suficiente evidencia en los caracteres medidos como para separar la especie en varios grupos. En el análisis genético no se puede alcanzar una conclusión ya que el método es altamente sensible a la contaminación por ARN y a la degradación del ADN de las muestras obtenidas. En el cultivo de tejidos se logró poca producción de embriones a partir de meristemos. Los más exitosos son los meristemos de partes florales y raíces. Las hojas presentan una alta tasa de sobrevivencia pero no han producido embriones explantables. Las semillas tienen buena sobrevivencia. Se mantienen los clones sobrevivientes en el laboratorio de cultivo in vitro de la UVG. II. ANTECEDENTES Las orquídeas han sido depredadas de los bosques tropicales desde su descubrimiento. Las especies del género Lycaste no han sido la excepción. Se distribuyen en Latinoamérica, desde México hasta Perú, con unas pocas especies en el Caribe y Brasil. Las especies guatemaltecas son las más utilizadas para la hibridación ex situ en el mundo(Ames y Correl, 1953; Oakeley, 1998). Fueron introducidas, junto con otras especies de orquídeas y plantas epífitas, al Viejo Mundo durante el siglo XVIII, en embarques medidos en toneladas. Entre los cargamentos de plantas llevadas a Inglaterra durante los años comprendidos entre 1840 y 1870, fue descubierta Lycaste skinneri (Batem ex Lindley) Lindley. Esta especie consta de muchas variedades, entre ellas la L. skinneri var. rosea, que es la más común y la L. skinneri var. alba, la flor nacional de Guatemala, que es la 2 más cotizada por los horticultores. Las variedades presentan colores que van desde el rojo y morado hasta el blanco. De la variedad alba, solo se puede encontrar una planta en 2,000 plantas de Lycaste skinneri (Ames y Correl, 1953; Dix y Dix com. pers.; Oakeley, 1993). El 70% de los híbridos, registrados para este género, tiene en su acervo genético a L. skinneri. Este interés ha mermado el banco de germoplasma que se encontraba en los bosques nubosos de Guatemala, Chiapas (en México) y el norte de Honduras y El Salvador. El hábitat natural de esta especie es el bosque premontano húmedo y pluvial, con una precipitación anual entre 1,900 mm a 4,000 mm, ver Fig. 1. En Guatemala se encuentran en los bosques de la parte norte del país como Huehuetenengo, Quiche, Alta Verapaz, baja Verapaz, Zacapa e Izabal. En la parte sur existen dos áreas, una en el suroeste en San Marcos, Quetzaltenango, Totonicapán y Sololá y en el sureste en Jalapa, Jutiapa y Chiquimula. Cohabita con árboles como encinos, liquidambar, aguacatillo, laureles, y pino de candelaria, y también con helechos arborescentes (chipe), epífitas y otras plantas ornamentales (Dix y Dix, com.