UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Trabajo de Tesis Doctoral: Rol de la cutícula en la resistencia a insecticidas y en la comunicación química de insectos vectores de la Enfermedad de Chagas. Tesista: DULBECCO, Andrea Belén Directora: Juárez, M. Patricia Codirector: Girotti, Juan R. Año: 2019 El presente trabajo de tesis, para optar al grado de Doctor de la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad Nacional de La Plata, fue realizado en el Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata (INIBIOLP) "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner", de la Facultad de Ciencias Médicas, de la Universidad Nacional de La Plata, bajo la dirección de la Dra. Juárez, M. Patricia y la co-dirección del Dr. Girotti, Juan R. Trabajos publicados durante la realización de este trabajo de tesis: Dulbecco, A. B., Mijailovsky S. J., Girotti J. R., and Juárez M. P. 2015. Deltamethrin binding to Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) lipoproteins. Analysis by solvent bar microextraction coupled to gas chromatography. J. Med. Entomol. 52: 1254–1259. Calderón-Fernández, G. M., Moriconi, D. E., Dulbecco, A. B. and Juárez, M. P. 2017. Transcriptome analysis of the Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) integument. J. Med. Entomol. 54, 1531–1542. Dulbecco, A. B., Moriconi D.E., Calderón-Fernández G.M., Lynn S., McCarthy A., Juárez M.P., Pedrini N. 2018. Integument CYP genes belonging to the largest genome-wide cytochrome P450 expansions in triatomines contribute to deltamethrin resistance in Triatoma infestans. Sci Rep. DOI: 10.1038/s41598-018-28475-x Mi reconocimiento Al Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata y sus autoridades, el Dr. Horacio Garda y la Dra. Margarita García, por permitirme realizar este trabajo en sus instalaciones. A la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT) y al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), por las becas que me otorgaron oportunamente. A la Universidad Nacional de La Plata, CONICET y FONCyT, por los subsidios que permitieron financiar este trabajo. A la Sociedad Brasileña de Bioquímica y Biología Molecular por otorgarme la beca con las que pude realizar mi estancia de investigación en la Universidad Federal de Río de Janeiro (UFRJ). A las autoridades de la Facultad de Ciencias Exactas, que me aceptaron en la Carrera de Doctorado en la misma Facultad que me formó como Licenciada en Biotecnología y Biología Molecular. Mi agradecimiento A mis directores Patricia Juárez y Juan Girotti, por el apoyo y la dedicación a lo largo de todos estos años, y por incertivarme a crecer en el ámbito científico participando de congresos y estadías en otros laboratorios. A Nicolás Pedrini, no solo por ser parte importante de mi formación científica sino también por la calidad humana y gran entusiasmo que le aporta día a día al laboratorio. A Gustavo Calderón-Fernández por contribuir en mi formación en biología molecular. A Cecilia Fusé y Facundo Bozzolo por el mantenimiento del insectario. A Sergio Mijailovsky por sus aportes en química analítica. A la Dra. Katia Gondim y al Dr. David Majerowicz y todo su grupo de trabajo, por tan cordialmente recibirme en su laboratorio en el Instituto de Bioquímica Médica- UFRJ y hacerme sentir una más de su grupo. A las chicas del Laboratorio 12 y de Biología Molecular por todos los momentos compartidos, no solo en las tareas diarias sino también en el acompañamiento constante dentro y fuera del laboratorio, que hoy se reflejan en esta hermosa amistad que tenemos. En especial a Debo, mi co-equiper, porque con ella avanzamos juntas, porque compartimos muchas alegrías y algunos enojos, pero sobre todas las cosas porque ella siempre me aporta su actitud positiva. A mi familia, mis papás y mis hermanos, que ya son gran parte de todos mis logros. Cada día valoro más mi suerte de tenerlos. A mi sobrino Manu, que sin saberlo nuestras tardes de plaza fueron mi gran distracción este último tiempo, y al pequeño Tomi, por transmitirme su paz y tranquilidad. A mis amigas de siempre, las del colegio, las de “vóley”, las de la facu… que ya son parte de mi vida desde hace tantos años y me acompañan siempre. Y a mi boni, mi gran compañero de vida, con el que disfruto plenamente hasta de las cosas más simples y sencillas. Gracias por acompañarme, por hacerme feliz, por musicalizar cada uno de mis días. A todos ustedes, gracias. INDICE 1 INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 10 1.1 ENFERMEDAD DE CHAGAS ...................................................................................... 11 1.2 TRIATOMINOS ......................................................................................................... 14 1.3 INTEGUMENTO DE LOS INSECTOS ............................................................................ 15 1.3.1 Lípidos cuticulares ......................................................................................... 18 1.3.1.1 Comunicación química ...................................................................................................................... 21 1.3.1.2 Lípidos cuticulares en triatominos ..................................................................................................... 23 1.3.2 Metabolismo ................................................................................................... 27 1.3.2.1 CYP4G .............................................................................................................................................. 29 1.4 RESISTENCIA A INSECTICIDAS .................................................................................. 30 1.4.1 Mecanismos de resistencia ............................................................................. 33 1.4.1.1 Resistencia por modificación del sitio de acción ............................................................................... 33 1.4.1.2 Resistencia metabólica ...................................................................................................................... 33 1.4.1.3 Factor cuticular.................................................................................................................................. 35 1.4.2 Transporte de insecticidas .............................................................................. 37 2 OBJETIVOS ................................................................................................................ 39 2.1 OBJETIVOS GENERALES ........................................................................................... 39 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................... 39 3 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................... 40 3.1 INSECTOS ................................................................................................................ 41 3.2 PREPARACIÓN DE MUESTRAS .................................................................................. 42 3.2.1 Obtención de los lípidos ................................................................................. 42 3.2.1.1 Separación en columna ...................................................................................................................... 42 3.2.1.2 Cromatografía en capa fina ............................................................................................................... 43 3.2.2 Derivatización de alcoholes grasos. ............................................................... 44 3.2.2.1 Microextracción en fase sólida del espacio de cabeza (HS-SPME)................................................... 45 3.2.3 Obtención de hemolinfa .................................................................................. 47 3.2.3.1 Incubación con deltametrina ............................................................................................................. 47 3.2.3.2 Fraccionamiento de lipoproteínas ...................................................................................................... 47 3.2.3.3 Extracción de deltametrina ................................................................................................................ 48 3.3 ANÁLISIS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA GASEOSA CAPILAR (CGC) ......................... 49 3.3.1 Identificación de compuestos por CGC-MS ................................................... 51 3.3.2 Cuantificación de componentes lipídicos por CGC-FID ............................... 55 3.3.3 Cuantificación de deltametrina mediante CGC- µECD ................................. 57 3.4 ANOTACIÓN DE GENES Y RELACIONES FILOGENÉTICAS ........................................... 58 3.5 ANÁLISIS GÉNICOS .................................................................................................. 59 3.5.1 Obtención de los tejidos ................................................................................. 59 3.5.2 Extracción de ARN ......................................................................................... 60 3.5.3 Síntesis de ADN complementario ................................................................... 62 3.5.4 PCR cuantitativa ............................................................................................ 62 3.5.4.1 Diseño, determinación de eficiencia de amplificación y curvas de calibración de los cebadores ...... 64 3.5.4.2 Expresión diferencial de genes .........................................................................................................