Universidad de Murcia Centro de Edafología y Biología Departamento de Biología Vegetal Aplicada del Segura TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DEL ALBARICOQUERO (Prunus armeniaca L.), MEDIADA POR Agrobacterium, Y REGENERACIÓN DE PLANTAS TRANSFORMADAS César Petri Serrano Director: Dr. Lorenzo Burgos Tesis Doctoral Murcia, 2005 ÍNDICE RESUMEN ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 7 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------------ 11 INTRODUCCIÓN---------------------------------------------------------------------------------------------------- 15 El albaricoquero----------------------------------------------------------------------------------------------- 17 Descripción taxonómica y botánica de la especie------------------------------------------------------ 17 Importancia económica del cultivo----------------------------------------------------------------------- 18 Mejora genética del albaricoquero ----------------------------------------------------------------------- 19 Regeneración -------------------------------------------------------------------------------------------------- 22 Regeneración indirecta ------------------------------------------------------------------------------------ 23 Regeneración directa--------------------------------------------------------------------------------------- 24 Factores que afectan la regeneración -------------------------------------------------------------------- 25 El explanto ----------------------------------------------------------------------------------------------- 25 Componentes del medio de regeneración ------------------------------------------------------------ 27 Condiciones de cultivo---------------------------------------------------------------------------------- 28 Genotipo -------------------------------------------------------------------------------------------------- 28 Transformación------------------------------------------------------------------------------------------------ 32 Técnicas directas ------------------------------------------------------------------------------------------- 32 Técnicas indirectas ----------------------------------------------------------------------------------------- 33 Genes marcadores ------------------------------------------------------------------------------------------ 37 Marcadores de selección-------------------------------------------------------------------------------- 38 Marcadores de información (“genes chivatos”) ----------------------------------------------------- 39 Factores que afectan la eficiencia de transformación y la regeneración de planta transformada- 41 El explanto ----------------------------------------------------------------------------------------------- 41 La técnica------------------------------------------------------------------------------------------------- 41 Selección de transformantes --------------------------------------------------------------------------- 43 Plantas comercializadas que han sido genéticamente modificadas ------------------------------------ 45 Transformación genética de frutales leñosos-------------------------------------------------------------- 48 Cítricos------------------------------------------------------------------------------------------------------- 48 Kiwi ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 49 Manzano ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 50 Nogal--------------------------------------------------------------------------------------------------------- 51 Peral ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 54 Vid------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 54 Transformación genética de especies de Prunus---------------------------------------------------------- 56 Albaricoquero (Prunus armeniaca L.).------------------------------------------------------------------ 56 Almendro (Prunus dulcis [Miller] D.A. Webb) -------------------------------------------------------- 57 Cerezo (Prunus avium L.), guindo (Prunus cerasus L.) y patrones de cerezo --------------------- 58 Ciruelo (Prunus domestica L.)---------------------------------------------------------------------------- 59 Melocotonero (Prunus persica L.) ----------------------------------------------------------------------- 60 Estado actual y perspectivas de futuro --------------------------------------------------------------------- 66 MATERIALES Y MÉTODOS----------------------------------------------------------------------------------------- 71 Material vegetal ----------------------------------------------------------------------------------------------- 73 Helena----------------------------------------------------------------------------------------------------- 73 Canino ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 73 Optimización de la regeneración---------------------------------------------------------------------------- 75 Estrategia general de regeneración----------------------------------------------------------------------- 75 Efecto del volumen de medio ----------------------------------------------------------------------------- 76 Efecto del agente solidificante---------------------------------------------------------------------------- 76 Efecto del medio de proliferación ------------------------------------------------------------------------ 76 Efecto de inhibidores de la acción del etileno ---------------------------------------------------------- 76 Efecto de las poliaminas solas o en combinación con los inhibidores del etileno ----------------- 77 3 Efecto de pulsos con auxinas------------------------------------------------------------------------------77 Efecto de los antibióticos sobre el material no transformado -------------------------------------------78 Efecto de los antibióticos en la regeneración------------------------------------------------------------78 Antibióticos aminoglicósidos para seleccionar plántulas transformadas -------------------------78 Antibióticos para controlar el crecimiento de Agrobacterium -------------------------------------78 Efecto de los antibióticos sobre la proliferación --------------------------------------------------------79 Efecto de los antibióticos sobre el enraizamiento ------------------------------------------------------79 Ensayos previos a la transformación -----------------------------------------------------------------------81 Cepas bacterianas -------------------------------------------------------------------------------------------81 Infectividad de las cepas oncogénicas de Agrobacterium en albaricoquero (en invernadero)----83 Curvas de crecimiento de Agrobacterium ---------------------------------------------------------------83 Infectividad de las cepas desarmadas (in vitro) ---------------------------------------------------------84 Detección y evaluación de los genes marcadores-------------------------------------------------------86 Detección y evaluación del gen sgfp ------------------------------------------------------------------86 Detección y evaluación del gen uidA (gus) ----------------------------------------------------------86 Experimentos de transformación ----------------------------------------------------------------------------88 Establecimiento de un protocolo básico de transformación -------------------------------------------88 Factores que afectan la virulencia de Agrobacterium --------------------------------------------------91 Aplicación de acetosiringona en el medio de cocultivo---------------------------------------------91 Aplicación de acetosiringona en el medio de cultivo de Agrobacterium -------------------------91 Influencia del pH del medio de cocultivo-------------------------------------------------------------92 Tratamientos de las hojas con celulasa----------------------------------------------------------------92 Transformación en vacío--------------------------------------------------------------------------------92 Producción de microheridas en las hojas mediante pinzas o sonicación--------------------------92 Factores que afectan al estado fisiológico de la planta-------------------------------------------------93 Retraso de la transformación ---------------------------------------------------------------------------93 Efecto sinergístico de las poliaminas y los inhibidores del etileno--------------------------------94 Influencia de pulsos de auxinas ------------------------------------------------------------------------94 Producción y cultivo de callos transformados ----------------------------------------------------------94 Evaluación molecular de los callos transgénicos. ------------------------------------------------------95 PCR--------------------------------------------------------------------------------------------------------95 Southern blot ---------------------------------------------------------------------------------------------96 Selección de plántulas transformadas ----------------------------------------------------------------------97 Selección con kanamicina ---------------------------------------------------------------------------------98 Efecto de los antibióticos aminoglicósidos en la selección y estímulo del crecimiento de