Imagem Ana Patrícia Amieiro Garrido RESISTANCE TO RECOMBINANT HUMAN ERYTHROPOIETIN THERAPY - STUDIES IN EXPERIMENTAL MODELS OF ANEMIA AND CHRONIC KIDNEY DISEASE Doctoral thesis in Health Sciences (Biomedical Sciences), supervised by Doctor Flávio Reis and Professor Alice Santos Silva presented to the Faculty of Medicine of the University of Coimbra July 2014 Cover illustration: Microscopy image (from the author) of connective tissue growth factor immunostaining in the glomerulus of a chronic renal failure rat kidney. Ana Patrícia Amieiro Garrido RESISTANCE TO RECOMBINANT HUMAN ERYTHROPOIETIN THERAPY - STUDIES IN EXPERIMENTAL MODELS OF ANEMIA AND CHRONIC KIDNEY DISEASE RESISTÊNCIA À TERAPÊUTICA COM ERITROPOIETINA RECOMBINANTE HUMANA – ESTUDOS EM MODELOS EXPERIMENTAIS DE ANEMIA E DOENÇA RENAL CRÓNICA Julho/2014 Tese de Doutoramento apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra para obtenção do grau de Doutor em Ciências da Saúde, no ramo de Ciências Biomédicas. Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Farmacologia e Terapêutica Experimental e no Instituto de Imagem Biomédica e Ciências da Vida (IBILI), da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra, sob orientação do Doutor Flávio Reis, e no Laboratório de Bioquímica da Faculdade de Farmácia e no Instituto de Biologia Molecular e Celular, da Universidade do Porto, sob co-orientação da Professora Doutora Alice Santos Silva, ao abrigo de uma bolsa individual de doutoramento (SFRH/BD/61020/2009) financiada pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) e com apoio do projeto PTDC/SAU-TOX/114253/2009 e do PEst- C/SAU/UI3282/2011, também financiados pela FCT e co-financiados pelo POPH-QREN (Fundo Social Europeu) e COMPETE. The results presented in this thesis have been published or were submitted for publication in international peer-reviewed journals: Book Chapter: Animal Models of Kidney Disease-Associated Anemia Patrícia Garrido, Elísio Costa, Alice Santos-Silva, Flávio Reis In book “Frontiers in Drug Discovery: Erythropoietic Stimulating Agents”, Bentham Science Publisher, Costa E, Reis F and Santos-Silva A Editors, pp.61-80, 2013. Manuscripts submitted: P. Garrido, S. Ribeiro, J.C. Fernandes, H. Vala, E. Bronze-da-Rocha, P. Rocha-Pereira, L. Belo, E. Costa, A. Santos-Silva, F. Reis. Iron-hepcidin dysmetabolism, anemia and renal hypoxia, inflammation and fibrosis in the remnant kidney rat model P. Garrido, S. Ribeiro, J.C. Fernandes, H. Vala, P. Rocha-Pereira, E. Bronze-da-Rocha, L. Belo, E. Costa, A. Santos-Silva, F. Reis. Impact of rHuEPO dose on iron metabolism and kidney hypoxia, inflammation and fibrosis in the remnant kidney rat model associated anemia J.C. Fernandes*, P. Garrido*, S. Ribeiro, P. Rocha-Pereira, E. Bronze-da-Rocha, L. Belo, E. Costa, F. Reis, A. Santos-Silva. Iron as the key modulator of hepcidin expression in erythroid antibody-mediated hypoplasia *Equally first authors Note: The results presented in Chapters III, IV and V are formatted according to the journal style the papers were submitted for publication, with some modifications. Part of the work presented in this thesis has received the following awards/prizes: One of the Best Abstracts presented by young authors at the 51th Congress of ERA- EDTA (European Renal Association - European Dialysis and Transplant Association) Regulation of liver and kidney erythropoietin gene expression in a rat model of anemia associated with chronic renal failure. João C. Fernandes, Sandra Ribeiro, Patrícia Garrido, José Sereno, Elísio Costa Flávio Reis, Alice Santos-Silva. 51th Congress of ERA-EDTA, May 31 - June 3, 2014, Amsterdam. One of the Best Abstracts presented by young authors at the 49th Congress of ERA- EDTA (European Renal Association - European Dialysis and Transplant Association) Early recombinant human erythropoietin treatment promotes cardiorenal cytoprotection in a rat model of chronic renal failure. Patrícia Garrido, Margarida Teixeira, Elísio Costa, Paulo Rodrigues-Santos, Belmiro Parada, Luís Belo, Rui Alves, Frederico Teixeira, Alice Santos-Silva, Flávio Reis. 49th Congress of ERA-EDTA, May 24-27, 2012, Paris. Best scientific work (oral presentation) on area of Basic Nephrology – Portuguese Society of Nephrology Erythropoietic response to rhEPO therapy is dependent on the stage of renal failure – an experimental study in nephrectomized rats Patrícia Garrido, João Fernandes, Elísio Costa, Sandra Ribeiro, José Sereno, Filipa Mascarenhas-Melo, Belmiro Parada, Luís Belo, Rui Alves, Frederico Teixeira, Alice Santos-Silva, Flávio Reis. Renal meeting 2012, XXVI Portuguese Congress of Nephrology, XXVI Congress of APEDT and IV Luso Brazilian Congress of Nephrology, March 28-31, 2012, Vilamoura. Best scientific work (oral presentation) on area of Basic Nephrology – Portuguese Society of Nephrology Anti-apoptotic and pro-proliferative action of early erythropoietin therapy in an animal model of moderate chronic renal failure P Garrido, M Teixeira, E Costa, P Rodrigues-Santos, B Parada, R Alves, F Teixeira, A Santos-Silva, F Reis. Renal meeting 2011, XXV Portuguese Congress of Nephrology and XXV Congress of APEDT, March 30 – April 2, 2011, Vilamoura. | Agradecimentos Agradecimentos Ao Senhor Doutor Flávio Reis, na qualidade de orientador, manifesto a minha profunda gratidão pela sábia orientação e incansável disponibilidade e forma singular de incentivo. Sem isso dificilmente conseguiria ultrapassar alguns momentos menos bons no decorrer deste trabalho. Obrigado, não só pela orientação, mas também pela amizade e confiança que depositou em mim durante estes últimos anos. À Senhora Professora Doutora Alice Santos Silva o meu sincero agradecimento pela imprescindível orientação, amizade, disponibilidade e interesse sempre manifestados na elaboração deste trabalho. Agradeço todo o apoio, críticas e sugestões que contribuíram, sem dúvida, para o enriquecimento do trabalho realizado. Ao Senhor Professor Doutor Frederico Teixeira, agradeço os sábios conhecimentos transmitidos e todas as críticas construtivas, que permitiram ultrapassar os resultados menos bons do início desta investigação. Ao Senhor Dr. Belmiro Parada e à Senhora Professora Doutora Petronila Rocha Pereira quero transmitir um reconhecido agradecimento pela indispensável colaboração, pela amizade, e por toda a boa disposição e palavras de alento. Estou grata à Professora Doutora Helena Vala, pela ajuda imprescindível, pelos valiosos ensinamentos, inteira disponibilidade e colaboração prestada no decorrer deste trabalho experimental. Quero ainda expressar um sincero agradecimento ao Senhor Victor Cortesão e à Senhora Dra. Paula Neto, dos Hospitais da Universidade de Coimbra, pela indispensável colaboração neste trabalho. Aos meus colegas e amigos do Porto, Sandra Ribeiro, João Fernandes e Elísio Costa um especial agradecimento pela imprescindível e incansável ajuda prestada durante o decorrer deste trabalho, que em muito contribuiu para o resultado final. Além disso, agradeço a amizade e os bons momentos que me deram oportunidade de partilhar convosco. Resistance to rHuEPO therapy - studies in experimental models of anemia and CKD| xi Agradecimentos | Um agradecimento muito especial à Filipa Melo, ao José Sereno, à Sara Nunes e à Tânia Martins que presenciaram mais de perto toda este percurso, e com as suas diferentes e singulares formas de ser conseguiram tornar todo este árduo trabalho em maravilhosos momentos de alegria e bom humor. Não posso deixar de agradecer à Ana Cristina Mega, à Sofia Baptista (apesar de distante) e à Sofia Viana a amizade, ajuda e companheirismo ao longo destes 4 anos. Com vocês os momentos menos bons foram bem mais fáceis de ultrapassar! A todos o meu obrigado. Bem-hajam! Não posso deixar de agradecer às minhas amigas Belinha e Diana a sincera amizade, a ajuda, o incentivo e a força que me deram para vencer os piores momentos desta caminhada. Obrigada por tudo! Ao Luís, por me mostrar que há outros caminhos, e que, apesar dos obstáculos encontrados neste ultimo ano, eu fui capaz de continuar a caminhar em frente… Aos meus Pais quero agradecer o amor incondicional, a força e o apoio que me transmitiram todos os dias, mesmo quando parecia não haver solução. Sem eles, não seria capaz de atingir esta meta. Obrigada, por me ajudarem a ser quem sou! Por fim, quero agradecer às diversas instituições que permitiram logística e financeiramente a realização deste trabalho durante estes anos, nomeadamente ao Laboratório de Farmacologia e Terapêutica Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra, ao Instituto de Imagem Biomédica e Ciências da Vida (IBILI), ao Laboratório de Bioquímica da Faculdade de Farmácia e ao Instituto de Biologia Molecular e Celular da Universidade do Porto, assim como à Fundação para a Ciência e a Tecnologia, ao Fundo Social Europeu (POPH-QREN) e COMPETE. xii |Resistance to rHuEPO therapy - studies in experimental models of anemia and CKD | Table of Contents Table of contents Agradecimentos .............................................................................................................................. xi Table of contents ........................................................................................................................... xiii List of Figures ................................................................................................................................. xvii List of Tables ................................................................................................................................... xix