Femtosecond Stimulated Resonance Raman Spectroscopy: Towards Mapping the Primary Steps in Biological Photoreceptors DISSERTATION zur Erlangung des akademischen Grades (Dr. rer. nat.) im Fach Chemie eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I Humboldt-Universität zu Berlin von Dipl.-Chem. Alexander Weigel Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin: Prof. Dr. Jan-Hendrik Olbertz Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I: Prof. Dr. Andreas Herrmann Gutachter: 1. Prof. Dr. Nikolaus Ernsting 2. Prof. Dr. Peter Hildebrandt 3. Prof. Dr. Klaus Rademann eingereicht am: 23. Dezember 2010 Tag der mündlichen Prüfung: 17. Februar 2011 Für meine Eltern und für Alexandra. „Es gibt ein großes und doch ganz alltägliches Geheimnis. Alle Menschen haben daran teil, jeder kennt es, aber die wenigsten denken je darüber nach. Die meisten Leute nehmen es einfach so hin und wundern sich kein bißchen darüber. Dieses Geheimnis ist die Zeit.” (Momo, Michael Ende) Abstract Femtosecond Stimulated Raman Spectroscopy is a powerful tool that allows to study the vibrational evolution of an excited chromophore directly in time. One perspective of this method is the elucidation of structural relaxation in biological photoreceptors. In this work the technique was built up and advanced towards applications to flavin-based proteins. Tunable Raman pulses were generated in a newly developed narrowband op- tical parametric amplifier (nb-OPA). These pulses provided the basis for transient Raman measurements with ∼ 10 cm−1 spectral and 50–100 fs temporal resolution. The signal/noise ratio in these experiments allows to increase the number of tran- sient spectra collected, by more than a factor of 10 compared to previous work. Resonance conditions strongly affect the appearance of the stimulated Raman spectra from an electronically excited state. The tunable Raman source was used to explore this effect to find optimal conditions. The charactistic spectral shape under typical resonance conditions was reproduced by simulations. Excited-state dynamics were first investigated for the model photoswitch stil- bene, starting from both the cis and the trans isomers. Decay, spectral shift, and narrowing of individual bands provided insight into the vibrational relaxation of the excited chromophore. Wavepacket motion was seen as oscillations of the Raman bands, and evidence for anharmonic coupling between different modes was found. Another chromophore that undergoes isomerization upon light excitation is the “parent” cyanine, 1,1’-diethyl-2,2’-pyrido cyanine iodide (PC). For this molecule the isomerization reaction could be followed to the ground state. From a global data analysis Raman spectra were obtained for the Franck-Condon region, the interme- diately populated hot ground state, and the isomerization products. As a basis for experiments on flavoproteins the excited-state properties of the pure flavin chromophore were studied in solution. Transient absorption and fluorescence experiments suggest an influence of dynamic polar solvation on the electronic properties of the excited state, and solvent-controled ππ∗-nπ∗ coupling is offered as an explanation. Raman spectra from the flavin excited state were recorded and the vibrational bands assigned. Population depletion by the Raman pulse was identified as a potential artefact in time-dependent measurements, but the effect was also used to mark wavepacket motion in the excited state. The application of the developed femtosecond stimulated Raman spectrometer to biological samples is demonstrated in a first FSRS experiment on glucose oxidase as a model flavoprotein. Spectra from the excited state were recorded, and the spectral evolution was followed in time. With transient absorption spectroscopy the BlrB-L66F and Slr1694-Y8F BLUF (Blue Light Using FAD) photoreceptor mutants were studied; signaling state formation and flavin reduction by a semiconserved tryptophan were seen, respectively. vii Zusammenfassung Femtosekundenaufgelöste Stimulierte Raman-Spektroskopie (FSRS) ist ein leis- tungsfähiges Werkzeug, das es erlaubt, die Schwingungsentwicklung eines angereg- ten Chromophors in Echtzeit zu studieren. Eine Perspektive dieser Methode ist die Aufklärung struktureller Relaxation in biologischen Photorezeptoren. In dieser Ar- beit wurde die Technik aufgebaut und weiterentwickelt, hin zu einer Anwendung auf flavinbasierte Photorezeptoren. Durchstimmbare Ramanimpulse wurden in einem neu entwickelten schmal- bandigen optisch-parametrischen Verstärker erzeugt und bildeten die Grundlage für transiente Ramanmessungen mit einer spektralen Auflösung von ∼ 10 cm−1 und einer zeitlichen Auflösung von 50–100 fs. Das Signal/Rausch-Verhältnis in diesen Experimenten erlaubt es, die Anzahl von Spektren in einer zeitaufgelösten Messung um mehr als einen Faktor zehn gegenüber vorherigen Arbeiten zu erhöhen. Die Resonanzbedingungen beeinflussen stark das Erscheinungsbild von stimu- lierten Ramanspektren aus einem elektronisch angeregten Zustand. Die durchstimm- bare Ramanquelle wurde dazu genutzt, diesen Effekt zu erforschen, um optimale Be- dingungen zu finden. Die charakteristische spektrale Linienform wurde für typische Resonanzbedingungen mit Simulationen reproduziert. Angeregte-Zustandsdynamik wurde zuerst für den Modellphotoschalter Stilben untersucht, ausgehend sowohl vom cis-, als auch vom trans-Isomer. Anhand der Intensitätsabnahme des Signals sowie der spektralen Verschiebung und Bandenver- schmälerung konnten Einblicke in die Schwingungsrelaxation des angeregten Chro- mophors erhalten werden. Wellenpaketbewegung wurde als Oszillation der Raman- banden beobachtet, und Anzeichen für die anharmonische Kopplung zwischen Mo- den wurden gefunden. Ein weiterer Chromophor, der unter Lichteinwirkung isomerisiert, ist das „Mutter”-Cyanin 1,1’-Diethyl-2,2’-pyridocyaniniodid (PC). Für dieses Molekül konnte die Isomierungsreaktion in den Grundzustand hinein verfolgt werden. Aus einer globalen Datenanalyse wurden Ramanspektren des Franck-Condon-Zustandes, des intermediär bevölkerten heissen Grundzustandes und der Isomerisierungspro- dukte erhalten. Als Grundlage für Experimente an Flavoproteinen wurden die Eigenschaften des angeregten Zustandes des reinen Flavinchromophors in Lösung studiert. Tran- siente Absorptions- und Fluoreszenzexperimente weisen auf den Einfluss von dy- namischer polarer Solvatation auf die elektronischen Eigenschaften des angeregten Zustandes hin. Lösungsmittelkontrollierte ππ∗-nπ∗-Kopplung wird als Erklärung vorgeschlagen. Es wurden Ramanspektren des angeregten Zustandes von Flavin aufgenommen und die Schwingungsbanden zugeordnet. Populationsverminderung durch den Ramanimpuls wurde als potentielles Artefakt in zeitaufgelösten Messun- gen identifiziert. Der Effekt wurde aber auch genutzt, um Wellenpaketbewegung im angeregten Zustand zu markieren. Die Anwendung des entwickelten femtosekundenaufgelösten stimulierten Raman- spektrometers auf biologische Proben wurde in einem ersten FSRS-Experiment an ix Glucose Oxidase als Modell-Flavoprotein demonstriert. Spektren vom angereg- ten Zustand wurden aufgenommen und die spektrale Entwicklung in der Zeit ver- folgt. Die BLUF (Blue Light Using Flavin) Photorezeptor-Mutanten BlrB-L66F und Slr1694-Y8F wurden mit transienten Absorptionsmessungen untersucht. Dabei wurde die Bildung des Signalzustandes bzw. eine intermediäre Reduktion des Flavins durch ein nahegelegenes Tryptophan beobachtet x Contents 1 Introduction1 2 Nonlinear Spectroscopy7 2.1 Theoretical Background............................8 2.1.1 The Density Matrix..........................8 2.1.2 Description of Mixed Systems.....................8 2.1.3 Time Evolution of a System...................... 10 2.1.4 The Induced Polarization....................... 12 2.1.5 Relaxation............................... 13 2.1.6 Propagation of the Electric Field through a Medium........ 15 2.1.7 Homodyne and Heterodyne Detection................ 16 2.1.8 Absorption of a Weak Probe..................... 17 2.2 Linear Spectroscopy.............................. 18 2.2.1 Absorption............................... 18 2.2.2 Stimulated and Spontaneous Transitions............... 19 2.3 Transient Absorption.............................. 21 2.4 Femtosecond Stimulated Resonance Raman Spectroscopy......... 26 2.4.1 Theoretical Description of FSRS Bandshapes............ 26 Formalism................................ 26 A compact form for the bandshape.................. 30 2.4.2 Simulation of FSRS Bandshapes for Typical Resonance Conditions 31 f ← e Resonance............................ 32 e → g resonance............................ 33 Simulataneous f ← e and e → g resonance.............. 34 e ← g resonance............................. 34 Summary of expected Raman contributions............. 34 Comparison to Spontaneous Raman Spectroscopy......... 35 3 Experimental Section 37 3.1 Linear Absorption and Fluorescence..................... 37 3.2 Generation of Ultrashort Laser Pulses.................... 37 3.2.1 Titanium-sapphire based laser systems................ 37 3.2.2 Nonlinear light conversion....................... 38 3.3 Fluorescence Upconversion........................... 39 3.4 Single-Shot Referencing in Transient Absorption and Raman Spectroscopy 40 xi Contents 3.5 The Femtosecond Stimulated Raman Spectrometer............. 44 3.5.1 The Narrow-band Optical Parametric Amplifier........... 44 3.5.2 Measurement Details.......................... 47 3.5.3 Spectral Calibration.......................... 48 3.5.4 Subtraction of Solvent Features...................