0 UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE MEDICINA FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ CENTRO DE PESQUISAS GONÇALO MONIZ UFBA FIOCRUZ CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA HUMANA E EXPERIMENTAL DISSERTAÇÃO DE MESTRADO ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL NA HEMOGLOBINOPATIA SC (HBB GLU6VAL E GLU6LYS): AVALIAÇÃO DE MARCADORES DE PROGNÓSTICO RAYRA PEREIRA SANTIAGO Salvador – Bahia 2016 1 FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ CENTRO DE PESQUISAS GONÇALO MONIZ Curso de Pós-Graduação em Patologia Humana e Experimental ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL NA HEMOGLOBINOPATIA SC (HBB GLU6VAL E GLU6LYS): AVALIAÇÃO DE MARCADORES DE PROGNÓSTICO RAYRA PEREIRA SANTIAGO Orientadora: Profª Drª Marilda de Souza Gonçalves Co-orientadora: Profª Drª Dalila Luciola Zanette Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Patologia Humana e Experimental para a obtenção do título de Mestre. Salvador – Bahia 2016 2 Ficha Catalográfica elaborada pela Biblioteca do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz / FIOCRUZ - Salvador - Bahia. Santiago, Rayra Pereira S235a Acidente Vascular Cerebral na Hemoglobinopatia SC (HBB glu6val e glu6lys): avaliação de marcadores de prognóstico. / Rayra Pereira Santiago. - 2016. 182 f. : il. ; 30 cm. Orientador: Profª Drª Marilda de Souza Gonçalves, Laboratório de Hematologia, Genética e Biologia Computacional. Dissertação (Mestrado em Patologia) – Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, 2016. 1. Doença SC. 2. Doppler. 3. Acidente vascular cerebral. I. Título. CDU 616.831-005.1 3 “ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL NA HEMOGLOBINOPATIA SC (HBB GLU6VAL E GLU6LYS): AVALIAÇÃO DE MARCADORES DE PROGNÓSTICO” RAYRA PEREIRA SANTIAGO FOLHA DE APROVAÇÃO Salvador, 11 de março de 2016 COMISSÃO EXAMINADORA 4 Vamos agradecer a todos, por que nessa vida a gente não faz nada sozinho. Saulo Fernandes 5 Dedico este trabalho aos pacientes com hemoglobinopatia SC, que superam dificuldades todos os dias. 6 AGRADECIMENTOS A Deus, por ter me concedido a vida, me ouvir nos momentos de clamor e me dar muitas bênçãos; Aos meus pais, Cleinilda e Eládio, pelo amor incondicional, carinho e palavras de incentivo; A minha segunda mãe e orientadora Marilda de Souza Gonçalves, por todo carinho, preocupação, aconselhamentos e ensinamentos; Ao meu irmão, Ravel, por toda a companhia durante a vida; Ao meu namorado, Rodrigo, por todo amor, companheirismo e apoio, que me fizeram superar momentos difíceis; A Dr. Camilo Vieira e Drª Isa Menezes Lyra por todo apoio na realização dos trabalhos e acompanhamento dos pacientes; A minha co-orientadora Dalila Luciola Zanette, por toda a ajuda nos momentos difíceis; Aos meus amigos e irmãos de laboratório, Aiala, Camylla, Caroline, Isa, Jeanne, Junia, Luciana, Magda, Milena, Rodrigo, Sânzio, Silvana, Thassila, Vitor e Corynne que sempre estavam lá para me dar apoio moral e “braçal” para prosseguir nessa empreitada; A Luciana Fiuza, pela confecção das imagens dessa dissertação; A todos do LHGB, pelas risadas e pelo carinho, em especial a Jaqueline por todas as gargalhadas e momentos de alegria; A todos do LPA, por todo apoio na realização das coletas e pela amizade, em especial a Jean, Elisângela, Joelma, Cynara, Karina, Mirela, Natalie e Modeste; Aos funcionários da LACTFAR/UFBA, por todo carinho, compreensão e apoio na realização desse trabalho; A todos os amigos da pós-graduação, pelo companheirismo, pelos momentos de superação e por toda alegria proporcionada; Aos médicos, funcionários e pacientes do HUPES, pela confiança e auxilio na realização desse trabalho; A FAPESB e a CAPES pelo suporte financeiro; Aos funcionários da biblioteca de Ciências Biomédicas Eurydice Pires de Sant'Anna; Enfim, a todos que auxiliaram de alguma forma no desenvolvimento desse trabalho. 7 SANTIAGO, Rayra Pereira. Acidente Vascular Cerebral na Hemoglobinopatia SC (HBB glu6val e glu6lys): avaliação de marcadores de prognóstico. 182 f. il. Dissertação (Mestrado) Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Salvador, 2016. RESUMO O acidente vascular cerebral (AVC) é uma complicação clínica grave da doença falciforme (DF). Poucos estudos avaliaram a velocidade do fluxo sanguíneo cerebral utilizando o Doppler transcraniano (DTC) e marcadores preditores do AVC na hemoglobinopatia SC (HbSC) e, desta forma, as velocidades consideradas de risco para os indivíduos com esta hemoglobinopatia são baseadas em velocidades descritas para a anemia falciforme (AF) e para a Sβ talassemia (HbS/β). Assim, o objetivo do presente estudo foi identificar marcadores preditores do AVC em indivíduos com HbSC, estabelecendo subfenótipos da doença pela associação de biomarcadores genéticos, hematológicos, bioquímicos e imunológicos com o valor da velocidade do fluxo sanguíneo cerebral. Para tanto, foi realizado um estudo transversal, onde foram investigados 68 indivíduos com HbSC. A velocidade média máxima do fluxo sanguíneo cerebral nas artérias cerebral média, carótida anterior e cerebral anterior foi determinada utilizando o DTC. Os marcadores hematológicos, bioquímicos e imunológicos foram avaliados por métodos automatizados e os marcadores genéticos que pudessem estar relacionados ao AVC foram identificados pelas técnicas de reação em cadeia da polimerase e Restriction Fragment Length Polymorphism além da avaliação de polimorfismos de nucleotídeo único na plataforma Illumina. A velocidade média máxima observada nos indivíduos com HbSC apresentou correlação negativa com marcadores hematológicos (hemácias, hemoglobina, hematócrito) e bilirrubina direta e correlação positiva com monócitos e ferritina. Os indivíduos com velocidades do fluxo sanguíneo cerebral superiores a descrita por Deane e colaboradores (2008) apresentaram menores valores de Red Cell Distribution Width (RDW) e óxido nítrico (NO), já os indivíduos com velocidades do fluxo sanguíneo cerebral superiores a Vieira e colaboradores (em submissão) apresentaram níveis inferiores de hemoglobina e hematócrito e superiores de ferritina. Usando o percentil 75 da velocidade do fluxo sanguíneo cerebral foi possível verificar que os indivíduos com velocidades superiores a 125,75 cm/s possuíam valores diminuídos de hemoglobina, hematócrito, RDW e NO e valores aumentados de ferritina. O perfil genético indicou que o polimorfismo no gene da MTHFR C677T e o genótipo selvagem para a talassemia alfa -3,7kb exerciam um efeito protetor em relação ao AVC e, portanto, podem vir a ser utilizados como indicadores preditivos de AVC nos indivíduos com HbSC. A velocidade de 125,75 cm/s pode ser a mais adequada para se avaliar os indivíduos com HbSC, porém são necessários mais estudos para identificar a associação dessa velocidade com o risco de AVC. A avaliação dos dados de sequenciamento de nova geração em indivíduos com HbSC e com o perfil de DTC anormal vs normal permitiu identificar que os genes DOCK6 rs2278426, TYR rs1042602, CYP4F2 rs2108622, MST1 rs3197999, OR51B5/6 rs5006884, THADA rs7578597, FUT2 rs602662, MTHFR rs1801133, TSEN15 rs1046934, CFB rs12614 e ABCG5 rs6756629 podem ser 8 preditores para a ocorrência do AVC. Os resultados deste trabalho sugerem que os indivíduos com HbSC e valor de DTC aumentados apresentam subfenótipo específico, caracterizado por um perfil hemolítico e inflamatório e com um perfil genético bem definido. Desse modo, sugerimos que a busca por marcadores preditores do AVC em indivíduos com HbSC é de grande relevância, uma vez que foi possível associar marcadores laboratoriais e genéticos com os resultados obtidos pelo DTC. Palavras chaves: Doença SC, Doppler transcraniano, acidente vascular cerebral, subfenótipos. 9 SANTIAGO, Rayra Pereira. Stroke in hemoglobinopathy SC (HBB glu6val and glu6lys): evaluation of prognostic markers. 182 f. il. Dissertação (Mestrado) Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Salvador, 2016. ABSTRACT Stroke is a serious clinical complication of sickle cell disease (SCD). Only few studies have evaluated the rate of cerebral blood flow by transcranial Doppler (TCD) and stroke predictor markers on hemoglobinopathy SC (HbSC), thus, velocity considered as risk for stroke that is used to diagnose HbSC individuals are based on velocities described for the sickle cell anemia (SCA) and Sβ thalassemia. The objective of this study was to identify predictors markers of stroke in individuals with HbSC, establishing subphenotypes disease by the association of genetic biomarkers, hematological, biochemical and immunological with the value of the velocity of cerebral blood flow. For that, we conducted a cross-sectional study, which were investigated 68 HbSC individuals. The average maximum rate of cerebral blood flow in the middle cerebral artery, anterior cerebral artery and anterior carotid artery was determined using the DTC. Hematological, biochemical and immunological markers were evaluated by automated methods and genetic markers that could be related to stroke were identified by polymerase chain reaction techniques and restriction fragment length polymorphism, in addition to the evaluation of single nucleotide polymorphisms was used the Illumina platform. The maximum average velocity observed in HbSC individuals, in turn, was negatively correlated with hematological markers (erythrocytes, hemoglobin, hematocrit) and direct bilirubin and positive correlation with monocytes and ferritin. Individuals with TCD velocities greater than what was described by Deane and colleagues (2008) showed lower RDW and nitric oxide, as individuals with higher TCD velocities than described by Vieira and colleagues (under submission) showed lower hemoglobin and hematocrit and higher ferritin levels.