UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA EVOLUTIVA E BIOLOGIA MOLECULAR / Hoplerythrinus unitaeniatus (Characiformes, Erythrinidae): um complexo de espécies. Estudos citogenéticos clássicos e moleculares Juliana de Fatima Martinez São Carlos 2014 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA EVOLUTIVA E BIOLOGIA MOLECULAR Hoplerythrinus unitaeniatus (Characiformes, Erythrinidae): um complexo de espécies. Estudos citogenéticos clássicos e moleculares Juliana de Fatima Martinez São Carlos 2014 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA EVOLUTIVA E BIOLOGIA MOLECULAR Hoplerythrinus unitaeniatus (Characiformes, Erythrinidae): um complexo de espécies. Estudos citogenéticos clássicos e moleculares Juliana de Fatima Martinez Dissertação apresentada ao programa de Pós- Graduação em Genética Evolutiva e Biologia Molecular do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal de São Carlos - UFSCar, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em Genética Evolutiva e Biologia Molecular. Orientador: Prof. Dr. Orlando Moreira Filho Co-orientador: Prof. Dr. Roberto Laridondo Lui São Carlos 2014 Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitária da UFSCar Martinez, Juliana de Fatima. M385hu Hoplerythrinus unitaeniatus (Characiformes, Erythrinidae) : um complexo de espécies. Estudos citogenéticos clássicos e moleculares / Juliana de Fatima Martinez. -- São Carlos : UFSCar, 2014. 113 f. Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São Carlos, 2014. 1. Citogenética de peixes. 2. Erythrinidae. 3. Diversidade cromossômica. 4. Marcadores genéticos. 5. Híbridos naturais. 6. DNA ribossômico. I. Título. CDD: 597.087322 (20a) Aos meus pais, Cassia e Geraldo. “Nem sempre podemos mudar o rumo das coisas. Mas podemos determinar a melhor forma de chegar ao final” (Sirlei L. Passolongo) AGRADECIMENTOS Agradeço à (aos): Deus, de Quem eu me afastei tantas vezes, mas que nunca se afastou de mim. Meus pais, Cassia e Geraldo, por todo amor, carinho e ensinamentos ao longo de todos esses anos. Amo vocês! E a toda minha família, em especial aos meus irmãos Jana e Léo, meu cunhado Cesar e minha sobrinha, minha linda bonequinha, Rafaela, pelo amor e apoio durante todos esses anos Meu orientador Prof. Dr. Orlando Moreira Filho pela oportunidade de realizar este trabalho. Além dos ensinamentos diários, confiança e amizade, que foram fundamentais em minha formação profissional e pessoal. Meu co-orientador Prof. Dr. Roberto Laridondo Lui, pela amizade, ensinamentos e paciência ao longo de todos esses anos. Minha eterna amiga e companheira de laboratório Josi, pelos dias bons e ruins de convivência, pelos ensinamentos e conversas, e por sempre estar disposta a me ajudar. Minha irmã do coração e pra quem eu digo que “amizade é um amor que nunca morre”. Todos os amigos e colegas de trabalho do laboratório de citogenética de peixes. Meu amigo Daniel pela amizade, ensinamentos e disposição em sempre ajudar. Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP – Processo Nº 2011/14960-0), pela bolsa concedida para a realização deste trabalho. ICMBio pela licença de coleta concedida. Todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, meu muito obrigada! DADOS CURRICULARES DO AUTOR JULIANA DE FATIMA MARTINEZ - Nasceu em 9 de dezembro de 1986, na cidade de São Carlos, SP, Brasil. Iniciou sua graduação em Licenciatura Plena em Ciências Biológicas no ano de 2007 na Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), campus de São Carlos. Durante a graduação foi bolsista de iniciação científica PIBIC/CNPq durantes os anos de 2008-2010 e bolsista FAPESP (Processo 2010/09325-1) nos anos de 2010-2011, ambos sob a orientação do Prof. Dr. Orlando Moreira-Filho. No ano de 2012 ingressou no mestrado pelo Programa de Pós Graduação em Genética Evolutiva e Biologia Molecular, na UFSCar, também sob orientação do Prof. Dr. Orlando Moreira-Filho e sob co-orientação do Prof. Dr. Roberto Laridondo Lui (professor adjunto da Universidade Estadual do Oeste do Paraná – UNIOESTE), sendo bolsista FAPESP (Processo 2011/14960-0). Durante esse período vem participando de projetos de pesquisa coordenados pelo seu orientador. Apresenta cinco artigos publicados em periódicos da área e um aceito para publicação. Participou de doze eventos científicos e possui vinte e oito resumos em anais de congressos. SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................................ i LISTA DE TABELAS .................................................................................................................... iii RESUMO ........................................................................................................................................ iv ABSTRACT .................................................................................................................................... vi 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 1 1.1. Ordem Characiformes ........................................................................................................... 1 1.2. Família Erythrinidae .............................................................................................................. 2 1.3. Gênero Hoplerythrinus .......................................................................................................... 3 1.4. Estudos cromossômicos em Hoplerythrinus unitaeniatus .................................................... 5 1.5. Considerações gerais sobre complexo de espécies em peixes .............................................. 7 1.6. Aspectos gerais sobre DNAs repetitivos ............................................................................... 9 1.7. Caracterização dos locais de estudo ........................................................................................ 13 Bacia do rio Amazonas ............................................................................................................... 13 Bacia do rio Araguaia-Tocantins ................................................................................................ 14 Bacia do rio Paraguai ................................................................................................................. 14 Bacia do Alto rio Paraná ............................................................................................................ 15 Bacia do rio São Francisco ......................................................................................................... 16 2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS .............................................................................................. 17 3. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................................... 18 3.1. Metodologia Clássica .......................................................................................................... 22 Tratamento “in vivo” .................................................................................................................. 22 Tratamento “in vitro” ................................................................................................................. 23 Método alternativo para a obtenção cromossomos em peixes ................................................... 23 Indução ao aumento do número de mitoses e suspensão de levedura ........................................ 24 Preparo de lâminas ..................................................................................................................... 25 Determinação de heterocromatina .............................................................................................. 25 Detecção de Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs) - Impregnação por prata ............... 25 Estudos cariotípicos ................................................................................................................... 26 3.2. Metodologia Molecular ....................................................................................................... 26 Extração de DNA total com fenol:clorofórmio .......................................................................... 26 Dupla e Simples Hibridização in situ Fluorescente, (protocolo de Pinkel et al. 1986) .............. 27 Obtenção e marcação das sondas ............................................................................................... 27 Dupla hibridização e detecção de sinal ...................................................................................... 28 Simples hibridização e detecção de sinal ................................................................................... 29 Simples Hibridização in situ Fluorescente (protocolo de Kubat et al. 2008) ............................. 30 Obtenção e marcação das sondas ............................................................................................... 30 Hibridização e detecção de sinal ................................................................................................ 30 Análise dos resultados ................................................................................................................ 31 4. REFERÊNCIAS (Introdução, Materiais e Métodos) ................................................................