ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΖΩΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΖΩΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΚΑΙ ΕΙΔΙΚΗΣ ΖΩΟΤΕΧΝΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Εντοπισμός γονιδιωματικών περιοχών και δικτύων γονιδίων που επηρεάζουν παραγωγικές και αναπαραγωγικές ιδιότητες σε πληθυσμούς κρεοπαραγωγικών ορνιθίων ΕΙΡΗΝΗ Κ. ΤΑΡΣΑΝΗ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: ΑΝΤΩΝΙΟΣ ΚΟΜΙΝΑΚΗΣ ΑΘΗΝΑ 2020 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Εντοπισμός γονιδιωματικών περιοχών και δικτύων γονιδίων που επηρεάζουν παραγωγικές και αναπαραγωγικές ιδιότητες σε πληθυσμούς κρεοπαραγωγικών ορνιθίων Genome-wide association analysis and gene network analysis for (re)production traits in commercial broilers ΕΙΡΗΝΗ Κ. ΤΑΡΣΑΝΗ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: ΑΝΤΩΝΙΟΣ ΚΟΜΙΝΑΚΗΣ Τριμελής Επιτροπή: Aντώνιος Κομινάκης (Αν. Καθ. ΓΠΑ) Ανδρέας Κράνης (Eρευν. B, Παν. Εδιμβούργου) Αριάδνη Χάγερ (Επ. Καθ. ΓΠΑ) Επταμελής εξεταστική επιτροπή: Aντώνιος Κομινάκης (Αν. Καθ. ΓΠΑ) Ανδρέας Κράνης (Eρευν. B, Παν. Εδιμβούργου) Αριάδνη Χάγερ (Επ. Καθ. ΓΠΑ) Πηνελόπη Μπεμπέλη (Καθ. ΓΠΑ) Δημήτριος Βλαχάκης (Επ. Καθ. ΓΠΑ) Ευάγγελος Ζωίδης (Επ.Καθ. ΓΠΑ) Γεώργιος Θεοδώρου (Επ.Καθ. ΓΠΑ) 2 Εντοπισμός γονιδιωματικών περιοχών και δικτύων γονιδίων που επηρεάζουν παραγωγικές και αναπαραγωγικές ιδιότητες σε πληθυσμούς κρεοπαραγωγικών ορνιθίων Περίληψη Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ο εντοπισμός γενετικών δεικτών και υποψηφίων γονιδίων που εμπλέκονται στο γενετικό έλεγχο δύο τυπικών πολυγονιδιακών ιδιοτήτων σε κρεοπαραγωγικά ορνίθια. Μία ιδιότητα σχετίζεται με την ανάπτυξη (σωματικό βάρος στις 35 ημέρες, ΣΒ) και η άλλη με την αναπαραγωγική ικανότητα (αριθμός αυγών ανά όρνιθα, ΑΩ). Για το σκοπό αυτό, διεξάχθηκαν γονιδιωματικής κλίμακας αναλύσεις συσχέτισης (GWAS) δεικτών-φαινοτυπικών τιμών και χρησιμοποιήθηκαν διάφορα εργαλεία Βιοπληροφορικής για τον εντοπισμό υποψηφίων λειτουργικών γονιδίων που επηρεάζουν έκαστη ή και τις δύο ιδιότητες, ταυτόχρονα. Στο Κεφάλαιο 1 περιγράφεται η βέλτιστη στρατηγική δειγματοληψίας για τον εντοπισμό υπευθύνων γενετικών δεικτών και γονιδίων όταν λόγω περιορισμένων οικονομικών πόρων δεν είναι δυνατή η γονοτύπηση του συνόλου των ατόμων ενός πληθυσμού. Ειδικότερα, εξετάστηκε η αποτελεσματικότητα εναλλακτικών σεναρίων τα οποία περιελάμβαναν τυχαία υποσύνολα καθώς και υποσύνολα ακραίων φαινοτύπων μεγέθους 5% έως 50% ενός συνολικού πληθυσμού 6.700 ορνιθίων κρεοπαραγωγής. Το πιο αποτελεσματικό σενάριο δειγματοληψίας προσδιορίστηκε συγκρίνοντας τους στατιστικώς σημαντικούς δείκτες μεταξύ των υποσυνόλων και ολόκληρου του πληθυσμού. Στο βέλτιστο σενάριο, η αναζήτηση των πλέον πιθανών υποψηφίων δεικτών για την ιδιότητα βασίστηκε στο ποσοστό της φαινοτυπικής διακύμανσης που αυτοί εξηγούν χρησιμοποιώντας ένα κατώτερο όριο της τάξεως του 1%. Ως βέλτιστο σενάριο δειγματοληψίας αναδείχθηκε η χρησιμοποίηση του ημίσεος του συνολικού πληθυσμού το οποίο περιλαμβάνει ακραίες (υψηλές και χαμηλές) φαινοτυπικές τιμές για την ιδιότητα. Στο σενάριο αυτό, εντοπίστηκαν συνολικά πέντε δείκτες οι οποίοι εδράζουν εντός ή εγγύς έξι γονιδίων (CACNB1, MYOM2, SLC20A1, ANXA4, FBXO32, SLAIN2) και δέκα δημοσιευμένων ποσοτικών γονιδιακών τόπων (QTLs) σχετιζόμενων με την ανάπτυξη. Τα παρόντα ευρήματα έδειξαν ότι υπό συνθήκες περιορισμένων πόρων, η διεξαγωγή GWAS με το ήμισυ του πληθυσμού το οποίο περιλαμβάνει ακραίους φαινοτύπους για την ιδιότητα συνιστά μια αποτελεσματική στρατηγική για τον εντοπισμό υποψηφίων γονιδίων. Στο Κεφάλαιο 2 διερευνάται η χρησιμότητα διαφόρων βιοπληροφορικών εργαλείων κατά την αναζήτηση λειτουργικών γονιδίων για ποσοτικές ιδιότητες όπως το ΣΒ. Αρχικά διεξήχθηκε ανάλυση συσχέτισης γενωμικών δεικτών-φαινοτυπικών τιμών για την ιδιότητα. Η ανάλυση αυτή ανέδειξε 12 στατιστικώς σημαντικούς δείκτες σχετιζόμενους με την ιδιότητα. Ακολούθησε αναζήτηση δημοσιευμένων ποσοτικών γονιδιακών τόπων (QTLs) και υποψηφίων γονιδίων εντός γενωμικών περιοχών εύρους 1 Mb γύρω από τους στατιστικώς σημαντικούς δείκτες. Η αναζήτηση αυτή ανέδειξε 1012 υποψήφια γονίδια θέσεως και 197 δημοσιευμένους QTLs σχετιζόμενους με την ανάπτυξη. Ακολούθησε λειτουργική ανάλυση (Functional Enrichment Analysis, FEA), ανάλυση ατραπών (Pathway Analysis, PA), τοπολογική ανάλυση δικτύου γονιδίων (Gene Network Analysis, GNA) και ανάλυση λειτουργικής προτεραιοποίησης (Gene functional Prioritization Analysis, GPA) με σκοπό την πρόβλεψη του λειτουργικού ρόλου των υποψηφίων γονιδίων. Η λειτουργική ανάλυση των υποψηφίων γονιδίων ανέδειξε 49 γονίδια ως εμπλεκόμενα σε αναπτυξιακές διαδικασίες ενώ 25 γονίδια βρέθηκαν να συμμετέχουν σε βιολογικές ατραπούς σχετιζόμενες με την ανάπτυξη. Η τοπολογική ανάλυση δικτύου γονιδίων και η ανάλυση λειτουργικής προτεραιοποίησης ανέδειξαν 14 κοινά γονίδια (UBC, SMAD4, SHC1, NRAS, PSMD4, CDC6, PSMD7, RARA, 3 PSMB4, CDH1, STAT5B, MED1, PSMD3, CDT1) ως πλέον σχετιζόμενα με την ιδιότητα. Η εφαρμογή των παραπάνω μεθόδων, είτε μεμονωμένα είτε συνδυαστικά, έδειξε ότι οι υπάρχουσες γνωσιακές βάσεις και τα διαθέσιμα εργαλεία μπορούν να συνεισφέρουν αποτελεσματικά στον εντοπισμό λειτουργικών γονιδίων για τις εξεταζόμενες ιδιότητες. Στο Κεφάλαιο 3 επιχειρήθηκε ανίχνευση δομών1 (modules) για τα υποψήφια γονίδια θέσεως και ακολούθως ανάλυση του λειτουργικού τους ρόλο με σκοπό τον εντοπισμό πλέον πιθανών γονιδίων για την ιδιότητα ΣΒ. Αρχικά, διενεργήθηκε γενωμική ανάλυση δεικτών- φαινοτυπικών τιμών. Ακολούθησε αναζήτηση δημοσιευμένων ποσοτικών γονιδιακών τόπων (QTLs) και γονιδίων θέσεως εντός γενωμικών περιοχών με υψηλά επίπεδα ανισορροπίας σύνδεσης (D′>0.8) γύρω από τους στατιστικώς σημαντικούς δείκτες. Η αναζήτηση αυτή ανέδειξε 645 υποψήφια γονίδια θέσεως γύρω από 11 στατιστικώς σημαντικούς δείκτες. Ακολούθησε εντοπισμός δομών εντός του δικτύου των υποψηφίων γονιδίων. Η ανάλυση αυτή ανέδειξε 5 δομές σχηματιζόμενες από 401 υποψήφια γονίδια. Η λειτουργική ανάλυση των γονιδίων που συνθέτουν τις παραπάνω δομές ανέδειξε 52 γονίδια ως συμμετέχοντα σε αναπτυξιακές διαδικασίες ενώ άλλα 14 γονίδια (GABRG1, NGF, APOBEC2, STAT5B, STAT3, SMAD4, MED1, CACNB1, SLAIN2, LEMD2, ZC3H18, TMEM132D, FRYL, SGCB) είχαν αποδεδειγμένα λειτουργικούς ρόλους σχετιζόμενους με την ανάπτυξη. Συνολικά, οι παραπάνω αναλύσεις ανέδειξαν 66 λειτουργικά γονίδια για την ιδιότητα, κάποια από τα οποία ήταν νέα και κάποια ήδη γνωστά. Στο Κεφάλαιο 4 διεξήχθησαν αναλύσεις συσχέτισης γενωμικών δεικτών-φαινοτυπικών τιμών με σκοπό τον εντοπισμό δεικτών που ασκούν προσθετικές ή/και κυριαρχικές επιδράσεις στην αναπαραγωγική ικανότητα (ΑΩ) των ορνίθων κρεοπαραγωγής. Ακολούθησε ποσοτική διερεύνηση του τρόπου δράσης των δεικτών και εντοπισμός υποψηφίων γονιδίων για την ιδιότητα. Συνολικά, εντοπίσθηκαν 17 στατιστικώς σημαντικοί δείκτες σε επίπεδο χρωμοσώματος εκ των οποίων 7 σχετίστηκαν με προσθετικής φύσεως, 4 με κυριαρχικές και 6 και με τις δύο μορφές επιδράσεων (προσθετικές και κυριαρχικές). Ειδικότερα, οι 4 δείκτες κυριαρχίας σχετίστηκαν με φαινόμενα μερικής έως πλήρους κυριαρχίας. Η αναζήτηση υποψηφίων γονιδίων εντός γενωμικών περιοχών 50 kb γύρω από τους στατιστικώς σημαντικούς δείκτες κατέδειξε συνολικά 57 υποψήφια γονίδια θέσεως. Η ανάλυση λειτουργικής ενίσχυσης των υποψηφίων γονιδίων έδειξε ότι δύο από αυτά (BHLHE40 και CRTC1) εμπλέκονται σε μηχανισμούς ανάδρασης του βιολογικού (cicardian) ρυθμού των πτηνών μέσω της φωτοπεριόδου. Επιπλέον, η ανάλυση λειτουργικής προτεραιοποίησης ανέδειξε επτά γονίδια (GDF15, BHLHE40, JUND, GDF3, COMP, ELF3, CRTC1) ως σχετιζόμενα με την αναπαραγωγή και δύο επιπλέον (ITPR1, ELL) με ποιοτικές ιδιότητες του αυγού. Συνολικά, τα ευρήματα του 4ου Κεφαλαίου υπογραμμίζουν τη σημασία και των μη προσθετικής φύσεως επιδράσεων στο γενετικό έλεγο της αναπαραγωγικής ικανότητας στις κρεοπαραγωγικές όρνιθες προτείνοντας παράλληλα νέα γονίδια για την ιδιότητα. Στο Κεφάλαιο 5 αναζητήθηκαν οι υπεύθυνοι μηχανισμοί για την παρατηρούμενη αρνητική γενετική συσχέτιση (rG=-0,17) μεταξύ τoυ σωματικού βάρους (ΣΒ) και της ωοπαραγωγικής ικανότητας (ΑΩ) σε κρεοπαραγωγές όρνιθες. Αρχικά, εφαρμόστηκε διμεταβλητή ανάλυση συσχέτισης γενωμικών δεικτών - φαινοτυπικών τιμών για τις δύο ιδιότητες. Η ανάλυση αυτή ανέδειξε 51 σημαντικούς δείκτες εκ των οποίων οι 13 ήταν ανεξάρτητοι (περιοχές με χαμηλά επίπεδα ανισορροπίας σύνδεσης). Ακολούθησε αναζήτηση δημοσιευμένων ποσοτικών γονιδιακών τόπων (QTLs) και υποψηφίων γονιδίων θέσεως που περιλάμβαναν τους ανεξάρτητους δείκτες. Η αναζήτηση αυτή οδήγησε στον εντοπισμό 17 δημοσιευμένων ποσοτικών γονιδιακών τόπων (QTLs) και 14 υποψηφίων γονιδίων θέσεως. Ακολούθησε 1 Σ’ ένα δίκτυο γονιδίων, ως δομή (gene module) ορίζεται ένα σύνολο γονιδίων του οποίου τα ‘εσωτερικά’ μέλη παρουσιάζουν υψηλότερο βαθμό συνδεσιμότητας (αριθμό αλληλεπιδράσεων) έναντι των ‘εξωτερικών’ μελών. 4 εξέταση των βιολογικών διεργασιών ανά υποψήφιο γονίδιο, η οποία ανέδειξε δύο γονίδια (ACVR1, CACNA1H) ως συμμετέχοντα σε αναπτυξιακές και αναπαραγωγικές βιολογικές διεργασίες. Ειδικότερα, το γονίδιο ACVR1 εμπλέκονταν άμεσα στην ανάπτυξη και στην αναπαραγωγή, ενώ το γονίδιο CACNA1H συμμετείχε άμεσα σε αναπαραγωγικές και έμμεσα σε αναπτυξιακές μεταβολικές λειτουργίες. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, τα δύο προαναφερθέντα γονίδια παρουσίασαν τεκμηριωμένη εμπλοκή σε αναπτυξιακές και αναπαραγωγικές βιολογικές λειτουργίες μέσω της συμμετοχής τους σε διάφορες βιοχημικές ατραπούς. Τα ευρήματα του παρόντος Κεφαλαίου συνεισφέρουν στην βαθύτερη κατανόηση του γενετικού μηχανισμού που ευθύνεται για την αρνητική γενετική συσχέτιση μεταξύ της ανάπτυξης και της αναπαραγωγής στα ορνίθια κρεοπαραγωγής, προτείνοντας υποψήφιους γενωμικούς δείκτες και γονίδια με πλειοτροπική δράση. Επιστημονικό πεδίο: Γονιδιωματική Λέξεις κλειδιά: κρεοπαραγωγικά ορνίθια, σωματικό βάρος στις 35 ημέρες, αριθμός