UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS ESCUELA DE POSGRADO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA, BIOLÓGICA Y MOLECULAR DE LA L- AMINOÁCIDO OXIDASA DEL VENENO DE LA SERPIENTE PERUANA Bothrops pictus “JERGÓN DE COSTA” TESIS Para optar al grado académico de Doctor en ciencias biológicas AUTOR Fanny Elizabeth Lazo Manrique Lima – Perú 2014 El presente trabajo de investigación se realizó en los Laboratorios de Biología Molecular, Microbiología y Biotecnología Microbiana, pertenecientes a la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, [Escriba aquí] A Dios Por la gran fuerza que nos guía A mis padres Alfonso y Gladys, por el ejemplo de vida, dedicación y cariño que siempre me fortalece. [Escriba aquí] A mi esposo por su compañerismo, comprensión, paciencia, apoyo invalorable a lo largo de todo este estudio y por todo el amor y cariño a mi dedicado A mis hijos Raisa y Renzo por su inmenso cariño, unión y comprensión y fuerza para seguir adelante [Escriba aquí] AGRADECIMIENTOS Agradezco infinitamente a mi asesor y amigo Dr. ArmandoYarlequé por su orientación, interés, paciencia, dedicación, facilidades para la realización de esta tesis, por todas sus enseñanzas y experiencias compartidas y por la confianza depositada en mí y en todos sus tesistas. Mi agradecimiento especial al Magíster Dan Vivas mi eterna gratitud por su cordialidad, apoyo invalorable y contribución en el desarrollo del presente trabajo. Al Magíster Gustavo Sandoval por su constante apoyo, colaboración y contribuciones en las investigaciones desarrolladas en el laboratorio de Biología molecular. A la Magíster Edith Rodríguez por su amistad y confianza durante todo el trabajo de investigación. Al gran Maestro Orestes Málaga que Dios tenga en su gloria, expreso mi sincero reconocimiento por sus consejos, por su valioso apoyo y fuerza para seguir adelante durante mis estudios de doctorado. A la Magíster Susana Gutiérrez del laboratorio de Microbiología y Biotecnología Microbiana por su orientación y ayuda prestada en el análisis de las pruebas microbiológicas. Al Dr. ( c ) Edgar Gonzalez Kozlova del Instituto de Ciencias Biológicas- Universidad Federal de Minas Gerais- Belo Horizonte-Brasil, por su constante apoyo en el análisis molecular. A los Biólogos: Julio Mendoza, Julio Delgadillo, César Ortiz, Frank Huari, por el constante apoyo y compañía durante la realización de este trabajo. [Escriba aquí] A todos aquellos que en el Perú dedican su tiempo, atención, trabajo e imaginación al noble animalito ponzoñoso con el fin de ayudarse mutuamente [Escriba aquí] CONTENIDO Pág. Resumen ……………………………………………………… 1 Abstract ……………………………….……………………… 2 Introducción …………………………………………………… 3 Antecedentes………………………………………………….. 8 Materiales y Métodos ……………………………………….. 16 Resultados ……………………………………………………. 34 Discusión …………………………………………………….. 70 Conclusiones …………………………………………………. 117 Referencias Bibliográficas ………………………………….. 119 Anexos…………………………………………………………... 146 [Escriba aquí] LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Deshidrogenación de L-aminoácidos catalizada por la L-aminoácido oxidasa………………………………...... 10 FIGURA 2. Bothrops pictus “Jergón de costa”………………. 16 FIGURA 3. Purificación de BpicLAAO en Sephadex G-100.................................................................... 36 FIGURA 4. Purificación de BpicLAAO en CM Sephadex C-50..……………………………. …………...... 36 FIGURA 5. Análisis de pureza de BpicLAAO por RP-HPLC............................................................................... 37 FIGURA 6. Electroforesis en PAGE de los pasos realizados para purificar BpicLAAO ………………………………………. 37 FIGURA 7. Electroforesis en PAGE-SDS…………………… 38 FIGURA 8. Determinación de peso molecular de BpicLAAO por PAGE-SDS………………………………………………..... 39 FIGURA 9. Determinación de peso molecular de BpicLAAO por cromatografía de filtración molecular…………………... 39 FIGURA 10. Efecto de la temperatura sobre la actividad de BpicLAAO …………………………………………….……... 41 FIGURA 11. Efecto del pH sobre la actividad de BpicLAAO……………………………………………………...... 41 FIGURA 12. Deglicosilación de BpicLAAO………………… 44 FIGURA 13. Actividad hemolítica de BpicLAAO…………..... 46 FIGURA 14. Formación de edema por acción de BpicLAAO……………………………………………………….. 47 FIGURA 15. Efecto edemático de BpicLAAO……………..... 47 FIGURA 16. Actividad hemorrágica de BpicLAAO…………. 48 FIGURA 17. Efecto hemorrágico de BpicLAAO…………..... 48 [Escriba aquí] FIGURA 18. Efecto de BpicLAAO sobre la agregación plaquetaria inducida por ADP………………………………… 49 FIGURA 19. Cálculo deIC50 de BpicLAAO sobre la agregación plaquetaria ……………………………………… 50 FIGURA 20. Efecto de la catalasa sobre la agregación plaquetaria inducida por ADP……………………………….... 50 FIGURA 21. Efecto antibactericida del veneno total y de BpicLAAO por el método de cilindro en placa…………… 52 FIGURA 22. Efecto de BpicLAAO sobre S. aureus y P. aeruginosa en presencia de catalasa……………………... 53. FIGURA 23.. Inmunodifusión eInmunolelectroforesis…….. 55 FIGURA 24. Capacidad neutralizante del suero antibotrópico polivalente sobra la actividad LAAO…….... …………………. 56 FIGURA 25. Electroforesis en gel de agarosa del cDNA que Codifica a BpicLAAO……………………………………………… 57 FIGURA 26. Secuencia de aminoácidos correspondientes a a BpicLAAO deducida del cDNA……………………………...... 59 FIGURA 27. Secuencia de la proteína madura de BpicLAAO……………………………………………………...... 60 FIGURA 28. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de BpicLAAO y de LAAOs de otras especies de la familia Viperidae……………………………… 64 FIGURA 29. Estructura secundaria de BpicLAAO…………. 65 FIGURA 30. Relación evolutiva de las LAAOs…………...... 66 FIGURA 31 a. Modelo teórico de la estructura terciaria de BpicLAAO…………………………………………………… 67 FIGURA 31b. Modelo estructural en donde se muestran los dominios de BpicLAAO……………………...... 68 FIGURA 31 c. Modelo estructural de superficie de BpicLAAO……………………………………………………….. 68 [Escriba aquí] FIGURA 32. Modelo teórico de la estructura cuaternaria de BpicLAAO………………………………………………….......... 69 LISTA DE TABLAS TABLA 1. Estabilidad de BpicLAAO a diferentes tiempos y pH……………………………………………………. 34 TABLA 2. Purificación de BpicLAAO………………………... 35 TABLA 3. Efecto de algunos iones metálicos sobre la actividad de BpicLAAO………………………………………… 42 TABLA 4. Acción de algunos inhibidores enzimáticos sobre la actividad de BpicLAAO………………………………. 43 TABLA 5. Carbohidratos asociados al veneno total y a BpicLAAO……………………………………………………….. 45 TABLA 6. Efecto antibacteriano del veneno total y de BpicLAAO por el método de cilindro en placa………………. 51 TABLA 7. Efecto antibcteriano de la tetraciclina sobre S. aureus y P. aeruginosa………………………………........ 54. TABLA 8. Secuencias homólogas a la secuencia nucleotídica de BpicLAAO……………………………………. 58 TABLA 9. Secuencias homólogas a la secuencia de aminoácidos de BpicLAAO…………………………………… 58 TABLA 10. Parámetros físicos y químicos obtenidos para la proteína deducida…………………………………………..... 61 TABLA 11. Comparación de las secuencias codificadoras de aminoácidos para las SVLAAOs…………………………… 62 TABLA 12. Aminoácidos que componen los tres dominios de BpicLAAO……………………………………………………. 64 TABLA 13. Efecto antibacteriano de diferentes venenos de serpientes por el método de difusión en disco……………… 103 [Escriba aquí] LISTA DE ANEXOS ANEXO 1. Pesos moleculares de algunas LAAOs purificadas de venenos de serpientes……………………………………….. 147 ANEXO 2. Actividad biológica de algunas SVLAAOs ………. 148 [Escriba aquí] ABREVIATURAS ADP Adenosina difosfato BpicLAAO L-aminoácido oxidase de Bothrops pictus BpicVT Veneno total de Bothrops pictus Cm-Sephadex C-50 Carboximetil Sephadex C-50 DEM Dosis edemática minima EDTA Ácido etilen diamino tetra acético FAD Flavina adenina dinucleótido FMN Flavina mononucleótido HPLC Cromatografía líquida de alta eficiencia kDa Kilo Dalton LAAO L-aminoácido oxidasa mg Miligramo ml Mililitro NaCl Cloruro de sodio PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida PMSF Fenil metil sulfonil fluoruro rpm Revoluciones por minuto SDS Dodecil sulfato de sodio SVLAAO L-aminoácido oxidasa de veneno de serpiente TEMED N,N,N,N’tetrametiletilendiamino Tris Tris hidroximetilaminometano μg Microgramo μl Microlitro [Escriba aquí] RESUMEN Se ha purificado y caracterizado la L-Aminoácido oxidasa del veneno de la serpiente Bothrops pictus “Jergón de costa” (BpicLAAO), mediante cromatografía de filtración molecular sobre Sephadex G-100, seguida de una cromatografía de intercambio catiónico sobre CM Sephadex C-50, ambas equilibradas con buffer acetato de amonio 0,05M pH 6. El grado de purificación fue de 22,02 veces con una actividad específica de 4,25 U/mg. La pureza de la proteína fue evaluada por HPLC en fase reversa y mediante PAGE-SDS. Es una proteína ácida conteniendo 18,7 % de carbohidratos asociados, con un peso molecular de 132,27 kDa, por cromatografía de filtración y de 65,2 y 58,6 kDa por PAGE- SDS bajo condiciones reductoras y no reductoras respectivamente, evidenciando que se trata de una enzima homodimérica con al menos un puente disulfuro intracatenario, el cual es importante para su actividad. El peso de la enzima disminuyó a 47 kDa después del tratamiento con PNGasa F. La enzima mostró un pH óptimo de 8,5 usando L-leucina como substrato, es inestable en el rango de pH alcalino a partir de 9,0; tolera hasta los 55 ºC. La actividad enzimática disminuyó considerablemente en presencia de Zn2+, glutatión y 2-mercaptoetanol, lo que sugiere la presencia de por lo menos un puente disulfuro intracatenario para su actividad. BpicLAAO presenta actividad hemorrágica sobre piel de ratones albinos siendo la dosis hemorrágica mínima de 2,79