Universidade Federal de Alagoas Instituto de Química e Biotecnologia Programa de Pós-Graduação em Química e Biotecnologia Ricardo Manoel dos Santos Silva Isolamento e identificação de fungos endofíticos de Abarema cochliocarpos (Gomes) Barneby & Grimes e Dalbergia ecastophyllum (L.) Taub., suas relações antagônicas e atividade antioxidante de seus extratos. Maceió 2011 Ricardo Manoel dos Santos Silva Isolamento e identificação de fungos endofíticos de Abarema cochliocarpos (Gomes) Barneby & Grimes e Dalbergia ecastophyllum (L.) Taub., suas relações antagônicas e atividade antioxidante de seus extratos. Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química e Biotecnologia da Universidade Federal de Alagoas, para a obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos Caetano Maceió 2011 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus pelo imenso milagre que é estar vivo e pela nítida noção que, inevitavelmente, cada dia é um novo começo. A vida é feita a cada dia, um de cada vez. Agradeço a Fapeal e a Capes por disponibilizarem a minha bolsa de doutorado. Agradeço ao professor Doutor Luiz Carlos Caetano por todo o tempo, paciência e conhecimentos investidos neste empreendimento que foi me orientar nestes anos. Sem você tudo seria diferente. Agradeço ao professor Doutor Luiz Antônio ferreira da Silva e todos do Laboratório de DNA Forense e Diagnóstico Molecular da Universidade Federal de Alagoas pelo trabalho de colaboração na análise molecular dos fungos. Agradeço a todos os professores do Instituto de Química e Biotecnologia por auxiliarem na minha formação acadêmica. Agradeço a minha família por me educar de forma excepcional sempre mostrando valores sólidos, limites e respeito ao próximo em um mundo como o de hoje. Amo todos do fundo do meu coração. Agradeço aos meus colegas de infância e que hoje são meus amigos/irmãos por sempre cobrarem de forma veemente a minha presença em todos os momentos de suas vidas. Amizade verdadeira não se abala com o tempo nem com a distância. Amo todos vocês. Agradeço aos colegas que encontrei no laboratório pelas trocas de experiência, ajuda e momentos incríveis de descontração. Várias pessoas entraram e saíram do laboratório, outros ainda estão nele, só gostaria de expressar a imensa admiração e respeito que sinto por todos. Vocês são e sempre serão maiores que as paredes que os cercam. Dedico este trabalho aos meus pais Everaldo Alves da Silva e Maria Valerita dos Santos Silva. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO......................................................................................................... 16 2 OBJETIVOS ............................................................................................................. 19 2.1 Objetivo geral: .......................................................................................................... 19 2.2 Objetivos específicos: ................................................................................................ 19 3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ............................................................................ 20 3.1 Microrganismos endofíticos ...................................................................................... 20 3.1.1 Considerações gerais ................................................................................................... 20 3.1.2 Microrganismos endofíticos e plantas medicinais ........................................................ 22 3.2 Antagonismo entre microrganismos ......................................................................... 27 3.3 Produção de substâncias antioxidantes por fungos endofíticos. .............................. 32 4 ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE ABAREMA COCHLIOCARPOS (GOMES) BARNEBY & GRIMES E DALBERGIA ECASTOPHYLLUM (L.) TAUB. ............................................................. 34 4.1 Introdução ................................................................................................................. 34 4.2 Material e Métodos ................................................................................................... 36 4.2.1 Escolha das espécies vegetais e local de coleta ............................................................ 36 4.2.2 Preparo dos meios de cultura para o isolamento de fungos endofíticos de A. cochliocarpos (Gomes) Barneby & Grimes e D. ecastophyllum (L.) Taub. ........................... 36 4.2.3 Coleta do material vegetal e isolamento dos fungos endofíticos de A. cochliocarpos (Gomes) Barneby & Grimes e D. ecastophyllum (L.) Taub................................................... 38 4.2.4 Identificação dos endofíticos através de técnicas moleculares...................................... 41 4.2.5 Manutenção dos fungos isolados de A. cochliocarpos (Gomes) Barneby & Grimes e D. ecastophyllum (L.) Taub. ...................................................................................................... 46 4.3 Resultados e Discussão .............................................................................................. 47 4.4 Conclusão .................................................................................................................. 66 5 EFEITO DE CONDIÇÕES ABIÓTICAS IMPOSTAS IN VITRO SOBRE O CRESCIMENTO RADIAL DOS FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE A. COCHLIOCARPOS E D. ECASTOPHYLLUM. ................................................................ 67 5.1 Introdução ................................................................................................................. 67 5.2 Materiais e Métodos .................................................................................................. 69 5.2.1 Preparação dos meios de cultura utilizados para o experimento sobre o crescimento radial dos fungos endofíticos isolados. ................................................................................. 69 5.2.2 Preparação da iluminação utilizada para o experimento sobre crescimento radial dos fungos endofíticos isolados. ................................................................................................. 72 5.2.3 Influência do meio de cultura e da iluminação in vitro sobre o crescimento radial dos fungos endofíticos isolados. ................................................................................................. 72 5.2.4 Delineamento experimental e análise estatística. ......................................................... 73 5.3 Resultados e discussão .............................................................................................. 74 5.4 Conclusão .................................................................................................................. 78 6 INTER-RELAÇÕES OBSERVADAS ENTRE OS FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE A. COCHLIOCARPOS . E D. ECASTOPHYLLUM . ............................ 79 6.1 Introdução ................................................................................................................. 79 6.2 Material e Métodos ................................................................................................... 81 6.2.1 Método de crescimento pareado em meio de cultura. .................................................. 81 6.2.2 Análise estatística do experimento de crescimento pareado em meio de cultura ........... 82 6.3 Resultados e Discussão .............................................................................................. 83 6.3.1 Cultura pareada do fungo endofítico Guignardia sp. (AcF2) isolado de A. cochliocarpos e os demais fungos endofíticos isolados de A. cochliocarpos e D. ecastophyllum. ................ 87 6.3.2 Cultura pareada do fungo endofítico da ordem Pleosporales (AcF3) isolado de A. cochliocarpos e os demais fungos endofíticos isolados de A. cochliocarpos e D. ecastophyllum. ..................................................................................................................... 90 6.3.3 Cultura pareada do fungo endofítico Phomopsis sp. (DeF1) isolado de D.ecastophyllum e os demais fungos endofíticos isolados de A. cochliocarpos e D. ecastophyllum. ................ 93 6.3.4 Cultura pareada do fungo endofítico DeF2 isolado de D.ecastophyllum e os demais fungos endofíticos isolados de A. cochliocarpos e D. ecastophyllum. ................................... 96 6.3.5 Cultura pareada do fungo endofítico Nigrospora sp. (DeNs) isolado de D. ecastophyllum e os demais fungos endofíticos isolados de A. cochliocarpos e D. ecastophyllum. ..................................................................................................................... 99 6.4 Conclusão ................................................................................................................ 102 7 PRODUÇÃO DE EXTRATOS A PARTIR DO MICÉLIO DOS FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE A. COCHLIOCARPOS E D. ECASTOPHYLLUM E ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DESTES. ............................................. 103 7.1 Introdução ............................................................................................................... 103 7.2 Material e Métodos ................................................................................................ 105 7.2.1 Preparação dos meios de cultura na produção de biomassa dos fungos endofíticos isolados de A. cochliocarpos e D. ecastophyllum. .............................................................. 105 7.2.2 Efeito da agitação do meio de cultura na produção de biomassa. ............................... 105 7.2.3 Análise estatística. ...................................................................................................