UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR Ciências Affinity purification and delivery of a p53-encoding plasmid DNA for gene mediated cancer therapy Joana Filipa Abreu Pereira Valente Thesis for obtaining Doctor Degree in Biochemistry (3º cycle of studies) Supervisor: Prof. Doutora Fani Pereira de Sousa Covilhã, november of 2018 Dedicatory To my family and closest friends… iii iv Acknowledgements I need to start this part by tell: “Professor, 2018 came too fast! Who will guess this in 2013?”. Having said that, I obviously need to start the acknowledgements by express my deepest gratitude to my supervisor Prof. Fani Sousa. Her guidance, knowledge, support, patience and precious revisions were crucial for the success of this work. I also want to express my deepest gratitude to Professor João Queiroz for all the knowledge and wise opinions transmitted during the development of the research work. I also gratefully acknowledge the financial support from the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), through the PhD fellowship (Ref SFRH/BD/96809/2013). I would also like to acknowledge to the Health Sciences Research Centre from the University of Beira Interior for give me the opportunity to develop this study on their facilities. Moreover, I would like to express my gratitude to all the people from the Health Sciences Research Centre and Biopharmaceuticals and Biomaterials group, who in one way or another helped me in the development of my work. A special thanks to my lab colleagues and, in particular to Ângela Sousa for their help and support in my panic/crazy times! The peace that you gave me in that times was priceless! I want to acknowledge to Professor Ana Cecilia Roque and their research group for so well received me during my stay at UCIBIO. It was an experience that I will always remember with affection. I am very grateful to my friends! Guys, I know that I’m not a person who shows as much affection as you want but, I really love you all! Thank you for being my rock especially during the times when trust and willpower were leaving me. Finalmente, não poderia acabar esta seção sem agradecer aos meus pais. Todo o vosso esforço culminou naquilo que sou e naquilo que alcancei até hoje! OBRIGADA! Sisters, you know, you are boring and annoying but I like you too…And never forget: We are unstoppable! In fact, I will never be able to express in words the deep gratitude towards all of those persons that were with me in this journey! THANK YOU ALL! v vi List of papers Papers included in the thesis resulting from this Doctoral work: I. p53 as the Focus of Gene Therapy: Past, Present and Future Valente, J. F. A., Queiroz J. A., Sousa F. Current drug targets (2018), In press. DOI: 10.2174/1389450119666180115165447 II. Dilemma on pDNA purification: binding capacity vs selectivity Valente, J. F.A., Queiroz J. A., Sousa F. Submitted for publication (2018) III. Selective purification of supercoiled p53-encoding pDNA with L-methionine– agarose matrix Valente, J. F. A., Sousa, A., Queiroz, J. A., Sousa, F. Analytical Biochemistry 459 (2014): 61-69. DOI: 10.1016/j.ab.2014.05.011 IV. DoE to improve supercoiled p53-pDNA purification by O-phospho-L-tyrosine affinity chromatography Valente, J. F. A., Sousa, A., Queiroz, J. A., Sousa, F. Submitted for publication (2018) V. Macroporosity in affinity chromatography: supercoiled p53 encoding plasmid isolation Valente, J. F. A., Sousa, A., Queiroz, J. A., Sousa, F. (Submitted for publication 2018) VI. The biological performance of purified supercoiled p53 plasmid DNA in different cancer cell lines Valente, J. F. A., Sousa, A., Gaspar V.M., Queiroz, J. A., Sousa, F. Submitted for publication (2018) VII. Plasmid DNA nano-complexation with Chitosan and Polyethyleneimine Valente, J. F. A., Sousa, A., Pereira P., Queiroz, J. A., Sousa, F. (In Preparation) vii Papers not included in the thesis: I. Affinity analysis and application of dipeptides derived from l-tyrosine in plasmid purification Ferreira, S., Carvalho, J., Valente, J. F. A., Corvo, M. C., Cabrita, E. J., Sousa, F., Queiroz, J. A., Cruz, C. Journal of Chromatography B 1006 (2015): 47-58. DOI: 10.1016/j.jchomb.2012.10.025 II. Microencapsulated Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles for Controlled Delivery of Bioactive Molecules and Cells in Bone Regeneration Valente, J. F. A., Gaspar, V. M., Antunes, B. P., Coutinho, P., Correia, I. J. Polymer 54.1 (2013): 5-15. DOI: 10.1016/j.polymer.2012.10.032 III. Poly (ester amide) s based on (L)-lactic acid oligomers and α-amino acids: influence of the α-amino acid side chain in the poly (ester amide) s properties Fonseca, A. C., Coelho, J. F., Valente, J. F. A., Correia, T. R., Correia, I. J., Gil, M. H., Simões, P. N. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition 24.12 (2013): 1391-1409. DOI: 10.1080/09205063.2012.762293 IV. Alginate based scaffolds for bone tissue engineering Valente, J. F. A., Valente, T. A. M., Alves, P., Ferreira, P., Silva, A., Correia, I. J. Materials science and engineering: C 32.8 (2012): 2596-2603. DOI: 10.1016/j.msec.2012.08.001 viii List of Scientific Communications Oral scientific communications of this Doctoral work: I. A library of amino acids to screen adsorbents suitable for sc p53 encoding plasmid isolation Valente J.F.A., Pinto J.M., Azevedo G.M., Pina A.S., Queiroz J.A., Roque A.C.A., Sousa F. II International Congress in Health Sciences Research: Towards Innovation and entrepreneurship (2017) Covilhã, Portugal II. Purification and delivery of the p53 pDNA genome guardian Valente, J. F. A., Sousa, A., Gaspar V.M., Queiroz, J. A., Sousa, F. XII ANNUAL CICS-UBI SYMPOSIUM (2017) Covilhã, Portugal III. p53 supercoiled encoding plasmid in different cancer cell lines – Transfection and Expression effects Valente, J. F. A., Sousa, A., Gaspar V.M., Queiroz, J. A., Sousa, F. Bio.Iberoamerica (2016) Salamanca, Spain IV. Superporous affinity chromatography for the supercoiled p53 encoding plasmid isolation Valente, J. F. A., Sousa, A., Cruz C., Queiroz, J. A., Sousa, F. ISPPP (2016) Salzburg, Austria V. Selective purification of supercoiled p53-encoding pDNA with L-methionine- agarose matrix Valente, J. F. A., Sousa, A., Queiroz, J. A., Sousa, F IX ANNUAL CICS-UBI SYMPOSIUM (2014) Covilhã, Portugal ix Poster presentations of this Doctoral work: I. Could it be possible to quickly determine the best ligands? Pinto J.M., Valente J.F.A., Pereira P., Pina A.S., Queiroz J.A., Roque A.C.A., Sousa F. II International Congress in Health Sciences Research: Towards Innovation and entrepreneurship (2017) Covilhã, Portugal II. Recovery of recombinant microRNAs with modified magnetic nanoparticles Pinto J.M., Figueiró G.A., Valente J.F.A., Pina A.S., Pereira P., Queiroz J.A., Roque A.C.A., Sousa F. XII ANNUAL CICS-UBI SYMPOSIUM (2017) Covilhã, Portugal III. Supercoiled p53-encoding plasmid purification by amino acids-based affinity chromatography – A comparison Valente, J. F. A., Sousa, A., Queiroz, J. A., Sousa, F. 9º ENCONTRO NACIONAL DE CROMATOGRAFIA / XVI COLACRO (2016) Covilhã, Portugal IV. Novel superporous arginine matrix for supercoiled p53 encoding plasmid isolation Valente, J. F. A., Sousa, A., Cruz C., Queiroz, J. A., Sousa, F. Microbiotec (2015) Évora, Portugal V. Purification of the supercoiled p53-encoding plasmid by a L-methionine-agarose matrix Valente, J. F. A., Sousa, A., Queiroz, J. A., Sousa, F. 10th ESBES-IFIBiop (2014) Lille, France VI. F. Sousa, p53 Supercoiled plasmid purification by l-methionine agarose matrix Valente, J. F. A., Correia I.J., Sousa, F 19th International Symposium on Separation Sciences (2013) Poreč, Croatia x Resumo alargado Introdução O cancro é uma das principais causas de morte em todo o mundo fazendo com que exista bastante investigação nesta área na tentativa de melhor compreender a doença e de desenvolver estratégias terapêuticas mais eficazes e seguras. Para o tratamento desta doença, a terapia génica e a vacinação com DNA foram propostas como alternativas às formas mais comuns de tratamento. Entre as várias alterações genéticas que podem ser responsáveis pelo processo oncogénico, estão incluídas as alterações relacionadas com a p53, nomeadamente em relação à sua expressão ou atividade. A p53 foi no passado considerada um oncogene no entanto, mais recentemente, provou-se que esta proteína é na realidade um supressor de tumor, muito poderoso envolvido em processos como a apoptose e a senescência. Esta “guardiã do genoma” atua sempre que as células são expostas a condições de stress, e alterações na estabilidade desta proteína podem resultar em instabilidade genómica. A p53 tem suscitado interesse em muitos grupos de investigação uma vez que está descrito que em 50% dos casos de cancro são identificadas mutações no gene que codifica a p53, enquanto os restantes 50% possuem componentes defeituosos na pós-tradução ou alterações nas vias de sinalização da p53. Diversos estudos demonstraram que a transfeção de células cancerígenas com o plasmídeo que codifica para a p53 pode direcionar as células para a apoptose e/ou para uma paragem no seu crescimento, sugerindo que uma abordagem relacionada com a terapia génica no tratamento do cancro pode promover o restabelecimento da função normal de p53. Portanto, é muito importante restabelecer a expressão e atividade da p53 em células cancerígenas. Neste sentido, a terapia génica tem já usado a possibilidade de induzir a expressão de p53, associando o gene que a codifica a vetores virais ou não-virais, nomeadamente com recurso ao DNA plasmídico (pDNA), como opção terapêutica promissora e alguns exemplos práticos já foram estudados e aplicados com sucesso. A utilização de vetores não-virais apresenta vantagens em relação ao uso de vetores virais, já que o processo de produção é mais simples, economicamente vantajoso, sendo os vetores menos imunogénicos e mais seguros.