Diversität der Wehrchemie von Blattkäferlarven Sequestrierung und de novo Synthese als Aspekte der Evolution von Chrysomeliden Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt dem Rat der Chemisch-Geowissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Schiller-Universität Jena von Dipl. Chem. Jürgen Kuhn geboren am 2. September 1973 in Bad Hersfeld Gutachter: 1. Prof. Dr. W. Boland 2. Prof. Dr. R. Beckert 3. Prof. Dr. S. Schulz Tag der öffentlichen Verteidigung: 16. Februar 2005 . lam plena omnia, omnia summis, mediis infimisque ordinibus fuerant distributa. Sed non erat paternae potestatis in extrema fetura quasi effetam defecisse, non erat sapientiae consilii inopia in re necessaria fluctuasse, non erat benefici amoris, ut, qui in aliis esset divinam liberalitatem laudaturus, in se illam damnare cogeretut. Statuit tandem optimus opifex, ut, cui dari nihil proprium poterat, commune esset, quicquid privatum singulis fuerat. Igitur hominem accepit indiscretae opus imaginis atque in mundi positum meditullio sic est alloquutus: ÀNec certam sedem nec propriam faciem nec munus ullum peculiare tibi dedimus, o Adam, ut, quam sedem, quam faciem, quae munera tute optaveris, ea pro voto, pro tua sententia habeas et possideas. Definita ceteris natura intra praescriptas a nobis leges coercetur. Tu nullis angustiis coercitus pro tuo arbitrio, in cuius manu te posui, tibi illam praefinies. Medium te mundi posui, ut circumspiceres inde commodius, quicquid est in mundo. Nec te caelestem neque terrenum neque mortalem neque immortalem fecimus, ut tui ipsius quasi arbitrarius honorariusque plastes er fictor, in quam malueris tu te formam effingas. Poteris in inferiora, quae sunt bruta, degenerare, poteris in superiora, quae sunt divina, ex tui animi sententia regenerari.¿ O summam dei patris liberalitatem, summam et admirandam hominis felicitatem, cui datum id habere, quod optat, id esse, quod velit. Bruta simulatque nascuntur, id secum afferunt (ut ait Lucilius) e bulga matris, quod possessura sunt. Supremi spiritus aut ab initio aut paulo mox id fuerunt, quod sunt futuri in perpetuas aeternitates. Nascenti homini omnifaria semina et omnigenae vitae germina indidit pater. Quae quisque excoluerit, illa adolescent er fructus suos ferent in illo: Si vegetalia, planta fiet. Si sensualia, obbrutescet. Si rationalia, caeleste evadet animal. Si intellec- tualla, angelus erit ei dei filius. Et si nulla creaturarum sorte contentus in unitatis centrum suae se receperit, unus cum deo spiritus factus in solitaria patris caligine, qui est super omnia constitutus, omnibus antestabit.Quis hunc nostrum chamaeleonta non admiretur?. Giovanni Pico della Mirandola, Oratio de hominis dignitate, 1486. II III Vorwort Diese Dissertation zeigt die Resultate meiner naturwissenschaftlichen Arbeit am Max-Planck-Institut für Chemische Ökologie in Jena. Als ich vor vier Jahren nach Jena gekommen bin, ahnte ich nicht, daß ich mich derart für Blattkäfer begeistern könnte, denn während meiner Diplomarbeit habe ich nicht mit lebenden Tieren experimentiert. Der permanente Umgang mit lebenden Organismen und die ständige Konfrontation mit biologischen Fra- gestellungen trugen dazu bei, diese faszinierenden Tiere auf gewisse Weise schätzen zu lernen und die Vorliebe des Schöpfers für Käfer durchaus nachzuvollziehen, schließlich ist die Ordnung der Käfer (Co- leoptera) mit mehr als 250.000 beschriebenen Spezies die größte unter allen Lebewesen. Die Eleganz, mathematische Logik und Symmetrie1 der Schöpfung bewunderte ich schon bei den rein physikalischen Untersuchungen in meiner Diplomarbeit, während mich die vielfältigen Möglichkeiten, die komplexen und anfangs scheinbar komplizierten Zusammenhänge der chemischen Ökologie beein- druckten. Und bei der vorliegenden Arbeit war es eine faszinierende Erkenntnis, daß alle biologischen Prozesse meist einer einfachen, aber genialen Ordnung folgen; festzustellen, wie so kleine, unschein- bare Kreaturen sich ausgefeilte Überlebensstrategien aneignen, die mir bis dahin nicht bewußt waren. Beispielsweise sind Larven des Großen Pappelblattkäfers (Chrysomela populi) so wählerisch mit ihrer Nahrung, daß sie lieber sterben, als ein ihnen nicht genehmes Blatt zu verzehren. Die Arbeit mit Tieren bereitete mir durch die interessante Aufgabenstellung sehr viel Freude, und ich habe gelernt mit Insekten umzugehen. Nicht zuletzt wegen zahlreicher, konstrukiver und manchmal kontroverser Diskussionen mit meinem Doktorvater Prof. Boland konnte ich darüber hinaus auch meine chemisch-analytischen Fähigkeiten und meinen Sinn für die Lösung wissenschaftlicher Probleme stei- gern. Bei diesen Tieren werden meistens kleine bis kleinste Mengen untersucht, die auch die moderne Analytik vor eine echte Herausforderung stellen. An dieser Arbeit sollte nachvollziehbar sein, daß das Ergebnis den Aufwand rechtfertigt. Besonders interessant war und ist für mich die Kombination verschiedener wissenschaftlicher Diszi- plinen, die nötig sind, um auf dem Feld der Bioorganik tätig zu werden. Die Fragestellungen sind biolo- gischer Natur, aber die Antworten werden durch chemische oder physiko-chemische Methoden geliefert. Wo die Chemie an ihre Grenzen kommt, greifen dann Biochemie und Molekularbiologie an, um festzu- stellen, wie die beobachteten Phänomene auf genetischer oder enzymatischer Ebene geregelt werden. Die Biologie stellt letztendlich alles in einen Kontext, wodurch sich der Kreis wieder schließt. Beeinträchtigt wurde diese wissenschaftlich Tätigkeit durch meine Krankheit, das heißt Operationen und die damit verbundene Genesungszeit, innerhalb der ich nicht in der Lage war, mich in vollem Umfang meiner Arbeit zu widmen. Deshalb möchte ich an dieser Stelle auch schon all den Menschen danken, die mir während dieser schweren Zeiten freundschaftlich und hilfreich zur Seite standen, ohne sie wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen. Meine Familie und meine Kölner Freunde haben mit mir gelitten und mich unterstützt. Für den experimentellen Teil meiner Arbeit wichtig und entscheidend aber war die Hilfe von Prof. Boland und meiner Kollegen Dr. Alice Shumate, Dr. Eva Petterson, Claes Johansson, Angelika Berg, Grit Winnefeld und Anja Bidermann, die während meiner meiner krankheitsbedingten (Zwangs-)Pausen für den Vollzug der zeitabhängigen Experimente gesorgt haben. Ihnen ist es anzurechnen, daß, solange ich stillgelegt war, dieses nicht auch für meine Arbeit zutreffen mußte. Zur Erfüllung der technischen Anforderungen der Friedrich-Schiller Universität wurde diese vorlie- gende Arbeit in LATEX 2" mit Dokumentklasse „book“ ohne besondere Abwandlungen der Standardsei- tenformatierung unter Debian Linux geschrieben und liegt als „Portable Document Format“ (.pdf) vor. Das Literaturverzeichnis wurde unter Zuhilfenahme von BIBTEX mit der unsrtdin.bst-Stildatei generiert, 1Hierzu kann ich dem interessierten Leser „Das elegante Universum“ von Brian Greene als Bettlektüre empfehlen. IV VORWORT die Literaturverzeichnisse gemäß der deutschen Zitierform DIN 1505 Teil 2 formatiert. Das Originaldokument ist ein einfaches Textdokument. Für die Graphiken wurde Encapsulated Post- Script (.eps) oder „Portable Network Graphic“ (.png) Format verwendet, das leichte Verwendbarkeit im Internet gewährleistet. Dieses Dokument folgt den Regeln der deutschen Rechtschreibung wie sie auch in der „Frankfurter Allgemeinen Zeitung“ und „Frankfurter Allgemeinen Sonntagszeitung“ und in der Zeitschrift „Spiegel“ und beim gesamten Springerverlag Anwendung finden. Jena, August 2004 Jürgen Kuhn INHALTSVERZEICHNIS V Inhaltsverzeichnis I Einleitung 1 1 Sequestrierung bei Insekten 1 2 Wehrchemie der Blattkäfer (Coleoptera: Chrysomelidae) 2 2.1 Chemische Abwehr der adulten Käfer . 2 2.2 Chemische Abwehr der Blattkäferlarven . 5 2.3 Biosynthese von Wehrverbindungen . 8 2.3.1 de novo Synthese von Iridoid Monoterpenen . 8 2.3.2 Sequestrierung phenolischer Glucoside . 8 2.3.3 Gemischte Strategie der Biosynthese . 8 3 Methoden zur Untersuchung von Transportmechanismen 11 3.1 Thioglycoside . 13 II Hauptteil 15 4 Aufgabenstellung 15 4.1 Untersuchung von Transportmechanismen bei Blattkäferlarven (Coleoptera: Chrysomeli- dae)............................................. 15 4.2 de novo Synthese und Sequestrierung im Chrysomela-Kladus – Untersuchung des acy- lierenden Enzyms bei C. lapponica ............................. 16 5 Ergebnisse und Diskussion 17 5.1 Transportuntersuchungen mittels Thioglycosiden . 17 5.1.1 Synthesen und Reinigung der Stoffwechselsonden . 17 5.1.2 Synthese acylierter Glycoside . 19 5.1.3 Synthese von Referenzestern . 19 5.1.4 Analytische Methodenentwicklung . 20 5.1.5 Züchtung der Käferlarven . 21 5.1.6 Sekret- und Hämolymphegewinnung . 22 5.1.7 Transportkinetik von Thiosalicin . 24 5.1.8 Transport von Thiosalicylalkohol . 25 5.1.9 Selektivität der Transporter . 26 5.1.10 Konkurrenzexperimente bei C. lapponica (Quey) . 35 5.1.11 Transportphänomene bei Chrysomelidenlarven . 37 5.2 Fluoreszenzmarkierung von Transportern . 38 5.3 Bestimmung des Ortes der Biosynthese bei de novo Synthetisierern . 40 5.4 Charakterisierung der Butyryltransferase von C. lapponica . 40 5.4.1 Nachweis der Enzymaktivität . 40 5.4.2 Bestimmung der Substratspezifität . 41 5.4.3 Bestimmung des butyrylübertragenden Cofaktors . 42 5.4.4 Charakterisierung und Isolierung des Enzyms . 43 VI INHALTSVERZEICHNIS 5.5 Glucosidasekinetik mit Sekret von C. populi ........................ 44 5.6 Isotopenmarkierte Verbindungen zur Aufklärung des Ursprungs von Wehrsubstanzen . 45 5.6.1 Fütterung isotopenmarkierter