Validierung eines Enzymimmunoassays und Entwicklung von Standardmaterialien für die Analytik freier und gebundener Triazinrückstände Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades des Fachbereichs Chemie der Universität Hamburg vorgelegt von Yasukazu Tambo aus Hamburg Hamburg 2002 II Y. Tambo: Dissertation. Hamburg (2002) 1. Gutachter: Prof. Dr. A. Knöchel 2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. W. Francke Widmung III Für Tjane und meine Eltern IV Y. Tambo: Dissertation. Hamburg (2002) Danksagung V DANKSAGUNG Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit vom Juni 1999 bis Juni 2002 im Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. A. Knöchel am Institut für Anorganische und Angewandte Chemie der Uni- versität Hamburg durchgeführt. Meinem Doktorvater Prof. Dr. A. Knöchel danke ich für die Unterstützung bei der Erstellung der vorliegenden Arbeit, seine wissenschaftliche Förderung sowie für die weitestgehenden Freiheiten, von denen mein Arbeiten geprägt war. Ein Projekt wie diese Dissertation kann nur auf der Basis eines gut funktionierenden Teams zu einem guten Ende geführt werden. Ganz besonders möchte ich in diesem Zusammenhang dem „Kapitän des Arbeitskreises“, Herrn Dr. Markus Cichon für die uneingeschränkte Unter- stützung und die geleisteten Hilfen in dieser Zeit danken. Ferner möchte ich auch den anderen Mitgliedern des Arbeitskreises für die gute Arbeitsatmosphäre, die zahlreichen Diskussionen und insbesondere die Erinnerung an gemeinsam verbrachte Probennahmen und Tagungen danken. Mein Dank richtet sich insbesondere an Frau Dipl.-Chem. Birgit „Taxi“ Runge, Herrn Dipl.-Chem. Dirk „Kollegiat“ Eifler, Herrn Dipl.-Chem. Frank „Regenbogen“ Miller, Herrn Dipl.-Chem. Thomas „Kienzel“ Kinzel und Herrn Dipl.-Chem. Jochen „dot net“ Feuer- born. Zu tiefstem Dank verpflichtet bin ich Frau Dr. A. Dankwardt für ihren qualifizierten, fachli- chen Rat und die unendliche Geduld, und der Fa. SENSION GmbH in Augsburg, die mit der Bereitstellung essentieller Antikörper und Enzymtracer für Enzymimmunoassays das Funda- ment dieser Arbeit gelegt hat. Herrn Prof. Dr. Dr. W. Francke danke ich für die Erstellung des Zweitgutachtens, daneben für die schöne Zeit in seinem Arbeitskreis. Die Schwerpunktarbeit, die meinen ersten Kontakt mit der Analytischen Chemie darstellte, hat meine wissenschaftliche Ausrichtung maßgeblich mitgeprägt. Herrn Dr. M. Preuße danke ich für die äußerst zuvorkommende Hilfe bei den mas- senspektrometrischen Untersuchungen. Herrn Dr. M. Weller (TU München) danke ich für unbürokratischen Transfer von Untersuchungsmaterial und Antikörpern, sowie die geleistete wissenschaftliche Hilfe. VI Y. Tambo: Dissertation. Hamburg (2002) Den Herren Andreas Bertscher, Sven Kloos, Markus Scheurell und Francis Hilscher danke ich für die geleisteten Arbeiten im Rahmen ihrer Forschungspraktika und für die Anregungen und Diskussionen. Herrn Dr. W. Herdering danke ich für die Bereitstellung von Modellsubstanzen für Fulvin- und Huminsäuren. Dem Sicherheitsingenieur des Fachbereichs Chemie, Herrn Dipl.-Ing. Dirk Wiedemann, so- wie Herrn Heinz Graeske vom Chemikalienlager der Anorganischen Chemie danke ich für die stets freundliche Unterstützung und Hilfsbereitschaft während meiner Zeit an der Universität. Den Bibliothekarinnen des Fachbereichs Chemie, allen voran Frau G. Oetken danke ich eben- so für die Unterstützung bei meinen umfangreichen Literaturrecherchen. Meinem Lehrer und Tutor Herrn Dipl.-Chem. Klaus Peters danke ich für die Begeisterung für die Chemie, die er mir während meiner Schullaufbahn eingepflanzt hat. Sie war die Basis für das Ergreifen eines naturwissenschaftlichen Studiums. Meiner Mutter Junko Tambo und meinem Vater Katsuhiko Tambo möchte ich meine Dank- barkeit aussprechen, dass sie mir in ihrer Liebe dieses Studium finanziell überhaupt ermög- licht haben. Ich bin stolz, solche Eltern haben zu dürfen. Meinen Freunden gilt mein Dank für die moralische Unterstützung über alle Phasen meines Studiums. Christiane, meinem lieben Engel, die mich durch die steinige Zeit gebracht hat, danke ich für die absolute Unterstützung und die stets aufmunternden Worte, die für mich in den letzten Jahren unverzichtbar waren. Motto VII 石の上にも三年 „Ishi no ue nimo sannen“ „Auch auf den Stein gehören drei Jahre“ Japanisches Sprichwort: Beharrlichkeit bringt Erfolg VIII Y. Tambo: Dissertation. Hamburg (2002) Inhaltsverzeichnis IX Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung und Problemstellung ___________________________________________ 1 2. Literaturteil____________________________________________________________ 3 2.1. Triazin-Herbizide_________________________________________________________3 2.1.1. Physikalische und chemische Eigenschaften _________________________________________4 2.1.2. Verhalten in der Umwelt_________________________________________________________5 2.1.2.1. Transport und Verlagerung in der Umwelt ______________________________________6 2.1.2.2. Metabolisierung und Biotransformation in Pflanzen_______________________________7 2.1.3. Analytik der Triazinherbizide ____________________________________________________11 2.1.3.1. Aufkonzentrierung der Triazine _____________________________________________12 2.1.3.1.1. Flüssig-Flüssig-Extraktion _______________________________________________12 2.1.3.1.2. Festphasenextraktion ___________________________________________________13 2.1.3.1.2.1. Festphasen für die Analytik von Triazinherbiziden ________________________14 2.1.3.1.2.2. Einfluß der Flußrate auf die Effizienz der Festphasenextraktion ______________15 2.1.3.1.2.3. Elutionsmittel für die Analytik von Triazinherbiziden______________________16 2.1.3.2. Detektion der Triazine_____________________________________________________17 2.2. Huminstoffe und refraktäre organische Säuren (ROS) _________________________19 2.2.1. Definition der Huminstoffe______________________________________________________20 2.2.1.1. Einteilung und Nomenklatur von Huminstoff-Fraktionen__________________________21 2.2.1.2. Isolierung und Fraktionierung von Huminstoffen ________________________________22 2.2.2. Genese von Huminstoffen_______________________________________________________26 2.2.3. Eigenschaften der Huminstoff-Fraktionen __________________________________________28 2.2.4. Zusammensetzung und Struktur von Huminstoffen ___________________________________30 2.2.5. Gebundene Rückstände_________________________________________________________34 2.2.5.1. Definition_______________________________________________________________34 2.2.5.2. Analytik von gebundenen Rückständen _______________________________________35 2.2.6. Modellsubstanzen für Huminstoffe________________________________________________37 2.2.6.1. Primärreaktionen der Modellbildung__________________________________________38 2.2.6.2. Modellsubstanzen für Huminstoff-gebundene Rückstände_________________________41 2.3. Antikörper _____________________________________________________________45 2.3.1. Struktur der Antikörper_________________________________________________________45 2.3.2. Genese und Produktion von Antikörpern ___________________________________________46 2.3.2.1. Immunogen _____________________________________________________________47 2.3.2.2. Polyklonale Antikörper ____________________________________________________48 2.3.2.3. Monoklonale Antikörper ___________________________________________________48 2.4. Immunoassays __________________________________________________________50 2.4.1. Theoretische Grundlagen _______________________________________________________51 2.4.1.1. Theoretische Grundlagen nicht-kompetitiver Immunoassays _______________________52 X Y. Tambo: Dissertation. Hamburg (2002) 2.4.1.2. Theoretische Grundlagen kompetitiver Immunoassays____________________________53 2.4.2. Labels ______________________________________________________________________57 2.4.2.1. Radionuklide ____________________________________________________________57 2.4.2.2. Lumineszenz ____________________________________________________________57 2.4.2.3. Enzyme ________________________________________________________________59 2.4.2.4. Optische Methoden _______________________________________________________61 2.4.3. Durchführung des kompetitiven Immunoassays ______________________________________64 2.4.4. Durchführung des nicht-kompetitiven Immunoassays _________________________________68 2.4.5. Auswertung von Immunoassays __________________________________________________69 2.4.6. Enzymimmunoassays für die Analytik von Triazinherbiziden ___________________________70 2.4.6.1. Antikörper für die Analytik von Triazinen _____________________________________70 2.4.6.2. Enzymtracer für die Analytik von Triazinen ____________________________________72 2.4.7. Immunfiltration _______________________________________________________________73 2.5. Methodenvalidierung_____________________________________________________76 2.5.1. Genauigkeit __________________________________________________________________77 2.5.1.1. Richtigkeit ______________________________________________________________77 2.5.1.2. Präzision _______________________________________________________________78 2.5.2. Spezifität und Selektivität _______________________________________________________80 2.5.3. Sensitivität___________________________________________________________________80 2.5.3.1. Nachweisgrenze__________________________________________________________81 2.5.3.2. Quantifizierungsgrenze (Bestimmungsgrenze) __________________________________82 2.5.4. Linearität und Arbeitsbereich ____________________________________________________82 2.5.5.