Tesis de Posgrado Identificación y caracterización de antígenos de Mycobacterium bovis Bigi, Fabiana 1998 Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias Biológicas de la Universidad de Buenos Aires Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente. This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source. Cita tipo APA: Bigi, Fabiana. (1998). Identificación y caracterización de antígenos de Mycobacterium bovis. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3064_Bigi.pdf Cita tipo Chicago: Bigi, Fabiana. "Identificación y caracterización de antígenos de Mycobacterium bovis". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1998. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3064_Bigi.pdf Dirección: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Contacto: [email protected] Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293 Universidad de Buenos Aires Facultad de Ciencias [Exactasy Naturales Identificación y caracterización de antígenos de Mycobacterium bovis Trabajos de tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas Fabiana Bigi Director: Dr. AngelAdrián Cataldi 1998 Lugar de Trabajo: Instituto de Biotecnología, CICV, INTA Castelar. m3U64.1 Agradecimientos A Angel, quien me dio la posibilidad de continuar con mi carrera y quien además de ser un excelente jefe e investigador es una persona maravillosa, le agradezco todo lo que de él aprendí y la confiaza que siempre me tuvo. A Marisa, mi compañera y amiga, le agradezco su amistad y su apoyo incondicional. A Aliciaquien con su especial sensibilidad siempre estuvo cada vez que lo necesité. A Juan Carlos, por ser tan buen compañero. A Lauri,por todo lo que me enseñó, por ayudarme a resolver situaciones que me conflictuaban, aún a kilómetros de distancia, por su amistad y sobre todo por su admirable solidaridad. A Martín por su generosidad y compañerismo, a Andrea, Karina y Marisa por brindarrne su colaboración, sin olvidarme también de Tomás... Y a todos ellos por aguantarme!!! A Eleo por su invalorable apoyo, por su amistad y por compartir conmigo esta hermosa etapa que empezó hace casi un año. A Haydee por su cariño y afecto y porque este es en definitiva también su trabajo, a AliciaArese por su companía, por escucharme y por ayudarme con los ELISAS!!. Al“maestro” Silviopor sus enseñanzas, a Osvaldo por respaldarrne y apoyarme siempre. A mis queridas amigas, Daniela, Ceci V, Ceci T, Susana y Paula,. por hacer del trabajo un lugar especial donde, por sobre todas las cosas prevalece la amistad y el compañerismos. Gracias por estar y compartir conmigo estos maravillosos añosl. A Oscar, mi amigo, quien me dio un lugar en los momentos más difíciles, ayudándome cada vez que lo necesite, le agradezco todo Ioque hizo por mi y todo Ioque aprendí de él A Sebastián por auxiliarme con las benditas compus y por ser tan buen compañero. A Laura M.y Fernando por sus palabras de aliento que tanto me ayudaron. A Erika, Lela, Analía, Flavia, Guido y a todos los chicos de plantas, especialmente a Mariana y Ale T por sus útiles consejos, a Dalia, Magda, Diego, Marcela. Teresa, Carolina, Norma, Fernanda, Mercedes, también, Corina y Marisa LB, mis compañeras desde la facu a Nilda y al resto de las girasolas. A todos ellos les agradezco su apoyo y cariño! A Dino quien me dio aliento para seguir adelante. A Jorge por su excelente predisposición, siempre tratando de resolver los problemas de todos. A Daniel por su simpatía y sus mates, a Fabián por sus colaboración. A las chicas de Ia cocina, Isabel, Berta, Susana y Marcela por ayudarme siempre y soportar mis manías del autoclave! A Escandón por creer en mí. A Esteban por su muy buena predisposición para resolver mis problemas y responder a mis inquietudes. A Marta y Ani quienes siempre colaboraron conmigo, como así también le agradezco a Claudia las milgauchadas que me hizo, siempre con muy buena onda! A Perla y Eva, por las llamadas y por entender mis impaciencias. Al Dr. Palma por considerame y permitir que siguiera adelante. AI lnta, por que no solo es parte de mi vida sino también de la de mis hijos. A Mamá por auxiliarme con las búsquedas por Internet y por su apoyo incodicional, a Lucía y Manolo por prestarrne las compus. A Paula por socorrenne con la informática en todo momento, a Nati y Gaby por cuidarme los chicos, también le agradezco a Mecha, Martíny Fernando por que se que siempre podré contar con elllos. A Facundo por su cariño. A Hugo por entenderme y apoyarme siempre. A mis hijos, le agradezco el tiempo que les robé, a Juan por ser tan maduro y comprender mis ausencias y a Flor por cuidar a Eugenia con tanta dulzura y dedicación. INDICE Introducción . .. 1. Mycobacterium bovis 1.1 Mycobacterium bovis en bovinos 1.2 Tuberculosis bovina en Argentina 1.3 Situación epidemiológica de la tuberculosis bovina en Latino América y el Caribe 2. Mycobacterium bovr'sen humanos 3. Tuberculosis debido a Mycobacterium tuberculosis 4. Caracteristicas generales de las micobacterias 5. Patogenicidad 6. Inmunidad a la tuberculosis ....... 6.1 Inmunidad celular 6.2 Inmunidad humoral 7. Resistencia a la infeccióntubermlosa 8. Factores de virulencia 9. La vacunación 10. Antígenos 10.1 EI complejo..85 10.2 Proteínas de choque térmico............ 10.3 Antígenos inmunodominantes 10.4 Antígenos especie-específicos 10.5 Proteínas secretarias 10.6 Modificacionespostraduccionales en proteínas micobacterianas ............ 10.7 Proteínas con actividad emimátim 11 Diagnóstico 11.1 Prueba de la tuberculina 11.2 Linfoproliferación 11.3 Dosaje de y- interferón 11.4 Serología en M. b0vis 11.5 Serología en M.tuberculosis 68 Materiales y Métodos ................. ................. Bacterias, virus, células de insecto y medios de cultivo............................ .. 68 Construcción de la genoteca 68 Inmunoselección en placa de lisis 69 Deleciones con exonucleasa Ill 69 Preparación de extractos celulares y sobrenadantes 70 Western blot Obtención de suero policlonal 71 Secuenciación 71 Procedimientos de clonado Transformación de Echerichia. Coli 76 "FOQ’NP’Q'J‘P’NT‘P 11. Purificación de plásmidos ....... 76 12 Preparación de ANDmicobacteriano 77 13. Southern blot......... 77 14. Ensayo de reactividad de células-T 77 15. Ensayos enzimáticos 78 16. Determinación de la concentración de proteínas 78 17. Electroporaciones ....... .. ..... .. 78 18 Fraccionamiento subcelular 79 19. Separación de fases con tritón X-114 79 20. Marcación de proteínas con paimítico tritiado 80 21. Electoforésis en dos dimensione 80 22. Obtención de ARN 80 23. Northermblot 81 24. Primer extension 81 25. RT-PCR 82 26. Fracionamiento de Seibert 82 27. Deteción de proteínas glimsiladas 83 28. Marcación de proteínas con biotina 83 29. Inmunoprecipitaciones 84 30. Generación de baculovirus recombinantes 84 Lista de oligonucleótidns 86 Lista de plásmidnc 87 Resultados ........................................................................................... 88 1. Estudio del reconocimiento serológico a los antígenos de Mycobacterium anis 88 2. Clonado de antígenos micobacterianos 93 2.1.1 Construcción de la genoteca en el vector 7LZAP|I 93 2.1.2 Selección y caracterización de fagos recombinantes 94 2. 2. Estudio y caracterización de los antígenos P36 y P27............................. .. 97 2.2.3 Antígeno P36 97 2.2.3.1 Caracterización de la proteína recombinante 97 2.2.3.2 Identificación de Ia proteína recombinante en M. bovis........................... .. 98 2.2.3.3 Clonado de la región codificante mmpleta 99 2.3.3.4 Determinación y análisis de Ia secuencia nuclentídim 99 2.2.3.5 Identificación de P36 en M. tuberculosis y M. bovis BCG 104 2.2.3.6 Reconocimiento por suero de bovinos tuberculosos y pacientes Ieprosos. 106 2.2.3.7 Subclonado de epitopes de P36 108 2.2.3.8 Expresión de P36 en sistemas heterólogos 111 Alta expresión de P36 en Echerichia coli 112 Clonado del gen de P36 en M. smegmatis 113 Clonado y expresión de P36 en el sistema Baculovirus/célula de insecto. 117 2.2.3.9 Expresión de la proteína natiVa 121 Estudio de la producción de P36 en M. tuberculosis y M. bovis BCG........ 121 2.2.3.10 Purificación y caracterización de P36 del sobrenadante de AN5............... 124 Marcación de proteínas con biotina 126 Estudio de modificaciones post-traduccionales 127 2.2.4 Antígeno P27 . 130 2.2.4.1 Clonado del gen que codifica para la proteína de 27kDa......................... .. 130 2.2.4.2 Expresión de P27 en E. coli 130 2.2.4.3 Obtención de un suero policlonal anti-P27 131 2.2.4.4 Localización de P27 en Mycobacterium bovis AN5 y Mycobacterium. tuberculosis H37Rv 131 2.2.4.5 Mapeo del gen P27 en el inserto de 2.0 kb 132 2.2.4.6 Análisis del mARNque codifica para P27 133 2.2.4.7 Reconocimiento inmune..... 136 Reconocimiento seroiógico a P27 recombinante 136 Reconocimiento de P27 recombinante por células T................................ .. 138 2.2.4.8 Presencia de P27 en otras micobacterias 138 2.2.4.9 Localización de la secuencia promotora del gen de P27.......................... .. 139 Clonado y expresión de P27 en M. smegmatis 139 2.2.2.10 Determinación del sitio de iniciación de Ia transcripción .......................... .. 143 2.2.2.11 Análisis de la secuencia 144 2.2.2.12 Clonado del gen homólogo a P27 148 2.2.2.13 Localización sub-celular de P27 150 2.2.2.14 Marcación de P27 recombinante con palmitato H3 152 Discusión ...............................