Cross-Pathway Control of the Pathogenic Fungus Aspergillus fumigatus : a Manifold Stress Response System Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Georg-August-Universität zu Göttingen vorgelegt von Christoph Sasse aus Hess. Lichtenau Göttingen 2008 Die vorliegende Arbeit wurde in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Gerhard H. Braus in der Abteilung Molekulare Mikrobiologie des Institutes für Mikrobiologie und Genetik der Georg- August-Universität Göttingen angefertigt. Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht in: Sasse, C., Bignell, E.M., Hasenberg, M., Haynes, K., Gunzer, M., Braus, G.H., and Krappmann, S. (2008) Basal expression of the Aspergillus fumigatus transcriptional activator CpcA is sufficient to support pulmonary aspergillosis. Fungal Genet Biol D7 Referent: PD Dr. Sven Krappmann Korreferent: Prof. Dr. G.H. Braus Tag der mündlichen Prüfung: 29.04.08 Für Anna und meine Eltern Danksagung Zunächst möchte ich PD Dr. Sven Krappmann danken, der mich während meiner Promotion hervorragend betreut hat und immer Zeit für Gespräche und Diskussionen hatte. Außerdem möchte ich ganz herzlich Herrn Prof. Dr. G.H. Braus danken, der es mir ermöglichte meine Doktorarbeit in seiner Abteilung anzufertigen. Dank gilt auch Prof. Dr. A.A. Brakhage und Dr. O. Kniemeyer, Dr. K. Haynes und Dr. E. Bignell, Dr. W. Nierman und Dr. S. Kim als auch Prof. Dr. M. Gunzer und M. Hasenberg für die gute Zusammenarbeit ohne die diese Doktorarbeit nicht entstanden wäre. Ebenfalls möchte ich mich ganz herzlich bei Karen Laubinger für die guten und aufmunternen Gespräche bedanken ebenso wie für die schöne gemeinsame Zeit im Labor 102. Auf diese Weise möchte ich auch Verena Große danken, die mir während meiner Doktorandenzeit viele Methoden gezeigt hat und das nötige Verständnis für Pilze beigebracht hat. Marc Dumkow, der immer Zeit für fachliche Gespräche hatte, möchte ich hiermit ebenfalls danken. Besonderer Dank gilt Daniela Justa-Schuch, Britta Herzog und Dr. Lars Fichtner, die sich Zeit genommen haben diese Arbeit gegenzulesen. Dank gilt auch allen Mitarbeitern der AG Braus für die schöne und angenehme Zeit. Zum Schluß möchte ich mich bei meiner Freundin Anna Bergamnn und bei meinen Eltern bedanken ohne deren Unterstützung diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG). Contents Summary ........................................................................................................................... 1 Zusammenfassung .......................................................................................................... 2 Chapter 1: Introduction ............................................................................................... 4 1.1 Life and characteristics of Aspergillus fumigatus ......................................................... 4 1.2 One fungus - three diseases: Aspergillus fumigatus & aspergillosis ............................. 6 1.2.1 The different types of disease ......................................................................... 7 1.2.2 The immune-defence-system and therapies against aspergillosis .................. 8 1.2.3 Virulence determinants of A. fumigatus ......................................................... 10 1.3 The lung as environment for A. fumigatus with nutrient limitation .............................. 12 1.4 The fungal Cross-Pathway Control System .................................................................. 13 1.4.1 Induction and regulation of the CPC/GC ....................................................... 14 1.4.2 CPC & Pathogenicity ..................................................................................... 17 1.5 Aim of this work ........................................................................................................... 18 1.6 References ..................................................................................................................... 20 Chapter 2: CpcA, a master regulator of stress response factors ....................... 28 2.1 Abstract ......................................................................................................................... 28 2.2 Introduction ................................................................................................................... 29 2.3 Materials and Methods .................................................................................................. 32 2.3.1 Strains and media ........................................................................................... 32 2.3.2 A. fumigatus transformation and plasmid construction .................................. 32 2.3.3 Growth tests .................................................................................................... 33 2.3.4 Transcriptome analysis and Northern hybridisation....................................... 33 2.4 Results ........................................................................................................................... 36 2.4.1 Transcriptional profiling of histidine-starved A. fumigatus reveals the CpcA-dependent transcriptome ...................................................................... 36 2.4.2 Estimation of the CpcA-dependent transcriptome.......................................... 37 2.4.3 The CpcA-directed transcriptome of A. fumigatus in comparison to the transcriptional profile elicited by voriconazole treatment .............................. 40 I 2.4.4 CpcA-dependent stress genes ......................................................................... 41 2.4.5 cdaA and cdaB appear to be regulated by the transcriptional activator CpcA ............................................................................................................... 43 2.4.6 Deletion of cdaA and cdaB results in increased sensitivity towards Calcofluor White ............................................................................................ 45 2.4.7 Calcofluor has no inductive effect on the Cross-Pathway Control ................ 49 2.5 Discussion ..................................................................................................................... 51 2.6 References ..................................................................................................................... 55 Chapter 3: Basal expression of Aspergillus fumigatus transcriptional activator CpcA is sufficient to support pulmonary aspergillosis ........................ 59 3.1 Abstract ......................................................................................................................... 59 3.2 Introduction ................................................................................................................... 60 3.3 Materials and Methods .................................................................................................. 62 3.3.1 Strains, media, and growth conditions ........................................................... 62 3.3.2 Transformation procedures ............................................................................ 62 3.3.3 Manipulation of nucleic acids and plasmid constructions .............................. 62 3.3.4 Biochemical methods and Western blots ....................................................... 63 3.3.5 Virulence tests in a murine model of pulmonary aspergillosis ...................... 63 3.3.6 Cell preparations ............................................................................................. 64 3.3.7 Fluorescence and light microscopy ................................................................ 64 3.4 Results ........................................................................................................................... 66 3.4.1 Phagocytosis by macrophages does not trigger CpcA expression in Aspergillus fumigatus ..................................................................................... 66 3.4.2 The Aspergillus fumigatus genome encodes a Gcn2p-like eIF2 α kinase ...... 68 3.4.3 Deletion of cpcC in A. fumigatus impairs the Cross-Pathway Control response .......................................................................................................... 69 3.4.4 A cpcC null mutant of A. fumigatus is still able to phosphorylate eIF2 α ...... 72 3.5 Discussion ..................................................................................................................... 75 3.6 References ..................................................................................................................... 78 II Chapter 4: The basal proteome directed by the Aspergillus fumigatus transcriptional regulator CpcA .................................................................................... 81 4.1 Abstract ......................................................................................................................... 81 4.2 Introduction ................................................................................................................... 82 4.3 Materials and Methods .................................................................................................. 84 4.3.1 Media, culture conditions and strains ............................................................. 84 4.3.2 Protein extraction and determination of concentration .................................. 84 4.3.3 2-D gel electrophoresis ................................................................................... 84 4.3.4 Visualisation