Université de Sherbrooke Etude des mécanismes de rétention du récepteur opioïde delta Par Etienne St-Louis Programme de Physiologie Mémoire présenté à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.) en Physiologie Sherbrooke, Québec, Canada 20 décembre 2016 Membres du jury d’évaluation Louis Gendron PhD Programme de Physiologie ; Directeur de recherche Jean-Luc Parent PhD Programme de Pharmacologie ; Co-Directeur de recherche Philippe Sarret PhD Programme de Physiologie ; Évaluateur interne Steve Jean PhD Département d'anatomie ; Évaluateur externe © Etienne St-Louis, 2016 ii RÉSUMÉ Etude des mécanismes de rétention du récepteur opioïde delta Par Etienne St-Louis Programme de Physiologie Mémoire présenté à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention du diplôme de maître ès sciences (M.Sc.) en physiologie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Québec, Canada J1H5N4 Mots clés : douleur, opioïde delta, DOPr, trafic intracellulaire, MOPr, cdk5, pin1, COPI Les médicaments de type opioïde représentent la classe de médicaments la plus utilisée pour les douleurs modérées à sévères. C’est pour cette raison que les opioïdes et leurs récepteurs sont très étudiés et qu’il y a beaucoup de publications sur ces récepteurs. En revanche, peu d’études ont cherché à identifier les partenaires d’interactions de ces récepteurs puis à comprendre les mécanismes d’adressage à la membrane. Même si le récepteur opioïde delta (DOPr) n’est pas encore ciblé en clinique, beaucoup d’équipes s’intéressent à son rôle et à l’effet d’agonistes DOPr dans le but de trouver une nouvelle avenue thérapeutique contre la douleur. Cependant, en condition normale, les agonistes DOPr ont un faible potentiel analgésique, expliqué par le faible niveau de DOPr à la surface cellulaire des neurones. C’est pourquoi il est important de comprendre son adressage à la membrane afin de combiner les traitements aux agonistes DOPr à une thérapie qui augmenterait l’expression de surface du récepteur. De plus, on sait qu’il existe un mécanisme de régulation de l’adressage de DOPr à la surface mais il reste peu compris. Nous avons donc analysé par spectrométrie de masse le complexe protéique résultant de l’immunoprécipitation de FlagDOPr, surexprimé dans des cellules HEK293, afin d’identifier de nouveaux partenaires d’interaction. Dans cette analyse, plusieurs protéines appartenant au complexe vésiculaire COPI ont été identifiées. Nous avons montré dans l’article que DOPr interagit avec COPI via les domaines intracellulaires 2 et 3 et que ces sites d’interaction sont responsables de la rétention de DOPr. De plus, mes travaux se sont penchés sur la régulation de DOPr à la surface cellulaire, telle que l’interaction DOPr avec les protéines cdk5 et pin1, deux protéines pouvant faire partie d’un mécanisme impliqué dans la régulation du transport de DOPr à la surface cellulaire. Comprendre l’export de DOPr est important pour le développement de nouvelles thérapies contre la douleur et plusieurs théories ont été abordées dans le cadre de mes travaux de maîtrise. iii TABLES DES MATIÈRES RÉSUMÉ ............................................................................................................................... ii TABLES DES MATIÈRES ................................................................................................. iii LISTE DES FIGURES ......................................................................................................... vi LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................... viii LISTE DES ABRÉVIATIONS ............................................................................................. ix 1. Introduction ...................................................................................................................... 11 1.1 Douleur ....................................................................................................................... 11 1.1.1. Voies ascendantes de la douleur ....................................................................... 11 1.1.2. Voies descendantes de la douleur .................................................................... 14 1.2. Les récepteurs opioïdes ............................................................................................ 14 1.2.1. Signalisation ....................................................................................................... 15 1.2.2. Physiologie .......................................................................................................... 16 1.2.3. Exemple de régulation par les opioïdes : la VTA ........................................... 17 1.2.4. Le système MOPr .............................................................................................. 18 1.2.4.1. Problèmes sociaux liés aux traitements opioïdes ......................................... 19 1.2.5. Le système KOPr ............................................................................................... 20 1.2.6. Le système DOPr ............................................................................................... 21 1.3. Intérêt de DOPr et problématique.......................................................................... 22 1.4 Synthèse de nouvelles protéines ............................................................................... 23 1.4.1. COPII et transport antérograde entre le RE et le Golgi ................................ 25 1.4.2. COPI et transport rétrograde entre le Golgi et le RE .................................... 26 1.5. Trafic intracellulaire de DOPr ................................................................................ 29 1.6. Régulation de l’expression de surface de DOPr .................................................... 32 1.6.1 Hétérodimère ...................................................................................................... 33 1.7. Protéines régulatrices potentielles .......................................................................... 34 1.7.1. Pin1 et cdk5 ........................................................................................................ 34 1.7.2. COPI ................................................................................................................... 36 2. But de l’étude ............................................................................................................... 38 3. Article ............................................................................................................................... 39 Résumé ................................................................................................................................. 40 iv Abstract ................................................................................................................................. 41 4. Méthodes (hors article) .................................................................................................... 72 4.1. Modification de la méthode d’ELISA .................................................................... 72 4.1.1. Chaperonne pharmacologique ......................................................................... 72 4.2 Purification des formes glycosylées de DOPr ......................................................... 72 5. Résultats (hors article) ..................................................................................................... 73 5.1 Interaction entre DOPr et COPI ............................................................................. 73 5.1.1. Effet de la surexpression de COPB1 sur l’expression de surface de DOPr . 73 5.5.1.1 Absence d’effet de COPB1 sur l’internalisation ........................................... 74 5.1.2. Interaction de COPB2 avec DOPr ................................................................... 74 5.1.3. Aucune modulation de l’interaction entre DOPr et COPB1 en co- expression avec MOPr ................................................................................................ 75 5.1.4. Modulation de l’expression de surface par la mutation de sites potentiels d’export. ....................................................................................................................... 76 5.1.5. Effet de la chaperonne pharmacologique NTI sur l’augmentation des récepteurs de surface ................................................................................................... 78 5.2. Interaction de DOPr avec la cdk5 et régulation par MOPr ................................. 79 5.2.1. La co-expression de MOPr et DOPr augmente l’expression de surface de DOPr. ............................................................................................................................ 79 5.2.2. La mutation de la T161 modifie l’interaction entre l'ICL2 et COPB1 ......... 81 5.2.3. Interaction entre DOPr et la cdk5 ................................................................... 81 5.2.4. Interaction entre DOPr et pin1 ........................................................................ 82 5.3. Résultats négatifs ...................................................................................................... 83 5.3.1 Interaction entre COPB1-myc et les domaines intracellulaires de DOPr ..... 83 5.3.2 Purification des formes glycosylées endogènes de DOPr à partir de tissus de rat ............................................................................................................................