UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE BIOLOGÍA L~I5309559428II¡III’IIUEUIii UNIVERSIDAD COMPLUTENSE TRATAMIENTOS NEONATALES Y DESARROLLO DEL SISTEMA OPIOIDE: ALTERACIONES NEUROENDOCRINAS Y COMPORTAMENTALES ASOCIADAS Tesis Doctoral presentada por 1 D. CARLOS DE CABO DE LA VEGA Directora It t~ 4- U ¾ Dra. M4 PAZ VIVEROS HERNANDO Madrid, 30 de Mayo 1993 A mi familia Esta Tesis Doctoral ha siclo realizada en el Departamento de Biología Animal II (Fisiología Animal) de Ja Facultad de Biología de la Universidad Complutense de Madrid bajo la dirección de la Dra. M4 Paz Viveros Hernando. AGRADECIMIENTOS Deseo expresar mi más profundo y cordial agradecimiento a la Dra. M~ Paz Viveros Hernando por su eficaz y siempre entusiasta labor de dirección de la presente Tesis Doctoral, así como por su continua disponibilidad, dedicación y ayuda. Quisiera agradecer al Dr. Rafael Hernández el haberme iniciado en el campo de la Neurofisiología y su decidido apoyo para comenzar y llevar a cabo mi investigación sobre este campo en el Departamento. Deseada mostrar mi gratitud sincera al Dr. Jan Kitchen de la Universidad de Surrey por haber aceptado que se realizaran en su laboratorio los experimentos de unión de ligando a receptor y sobre nocicepción, así como por su supervisión de mi trabajo en Surrey. También mi más cordial reconocimiento para Mary Kelly por haberme enseñado las técnicas que precisé emplear en dicha institución y su eficacísima y amable asistencia en todo momento. Mi agradecimiento también a las Dras. M~ Isabel Martín y W Isabel Colado del Departamento de Farmacología (Facultad de Medicina) sin cuya colaboración hubiera sido imposible la valoración de las monoaminas encefálicas, junto con mi gratitud por su valioso asesoramiento sobre estos temas. A la Dra. Rosa M~ Arahuetes debo agradecer su generosa y desinteresada cooperación en laestimación de los parámetros cerebelares, poniendo siempre a mi disposición el material e información necesarios para mi experimentación y aconsejándome en todo momento. Asimismo, quiero expresar mi agradecimiento a Yolanda Diebold por su inestimable asistencia en la puesta a punto de estas técnicas. Mi gratitud a las Dras. M4 Luisa Leret y M~ Isabel González por su orientación sobre la utilización de la pruebas comportamentales de tablero de agujeros y laberinto en cruz, así como sobre cuestiones de desarrollo y diferencias sexuales en los sistemas monoaminérgicos. Al Dr Julio Alonso (Departamento de Biomatemática) agradezco su amable y utilísimo asesoramiento sobre cuestiones estadísticas. Asimismo, mi agradecimiento a las Dras. Mercedes Alonso y Mónica de la Fuente, directoras del Departamento de Biología Animal 1] durante la realización de esta Tesis, por haberme permitido llevar a cabo este trabajo en dicha institución, dándome todo tipo de facilidades. No podría olvidar la ayuda insustituible de mi infatigable compa de laboratorio Andrés Pujol, cuya compañía fue además un gran estímulo y apoyo en los momentos más duros del trabajo (a pesar de que nunca haya valorado adecuadamente mis cualidades para el mando y el Cante hondo). También quiero agradecer muy especialmente a M~ Clara Sañudo su ayuda, preocupación y solidaridad durante mis comienzos en el Departamento y siempre; a W del Mar Sánchez sus consejos morfológicos; a Juan José Garrido su solícito aporte de separatas; a Ricardo Madrid su amistad invisible; a W del Mar González su contribución a mantener mis niveles de azucar en sangre; y a Elena Sánchez y M~ José González el haberse proclamado mis vecinasfavoritas. Deseo, asimismo, dar las gracias a mis compañeros de la School of Biological Sciences de ]a Universidad de Surrey -Andrea Dunphy, Julie Peachey, Julia Nicholís, Tracy Crook, Alison (Trudy) Kennedy. Lara Blann, Dala Muhammed, Colin Brown, Mark Bolton, David Hall. Steven Bailey, Gareth Shackleton, Abraham Iyambo, Nana Yeboah y Peitan Liu- por su extraordinaria acogida. Además deseo agradecer a mi colega de laboratorio Dean Hickman su valiosa asistencia en el manejo de materiales radiactivos, así como en los terribles dúos y corridas de toros realizados durante las largas incubaciones, para gran honor del personal, investigador y académico. Debo eterno agradecimiento a Javier Casado [Dr.] (Depto. Bioquímica, F. Biología, UCB), compañero de exilio en la Universidad de Surrey, por haberme guiado y protegido en mi primera llegada a Guildford, completamente pardillo, y haber sufrido pacientemente mis depres tras mis interminables jornadas de maratón de binding en el labbo. Tengo también una entrañable deuda de gratitud con Alexandra Salewski por prestar atención a mis aburridas disgresiones sobre Psiconeuroendocrinología (!?) en la cocina del viejo Wev 3 y haber seguido animándome desde entonces con tanto interés y cariño. A Myriam, Amadeo y Guille es necesario agradecerles la ilusión y entusiasmo con que en todo momento han seguido mis aventuras y desventuras (‘ientljwas. y el gran favor de permitirme utilizar las instalaciones de ROSTAND para imprimir esta Tesis. Y a mi hermano Antonio (auténtico bodoterreno) su continua ayuda en Jos diversas situaciones límite habidas durante estos años, y en especial su asistencia con los ordenadores e impresoras (incluyendo la presente) Esta Tesis ha contado con una Beca Predoctoral Complutense y ha recibido financiación de la CICYT (PBS6-0603) y del British Council. La 13-funaltrexamina utilizada en este trabajo fue donada generosamente por el Dr. P. Birch (GLAXO. Reino Unido>. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN.- ESTADO ACTUAL DE LA CUESTIÓN 1.1. Sistema opioide endógeno 1 ¡.1.1 Generalidades 1 1.1.1.1 Reseña histórica 1.1.1.2 Familias de péptidos opioides 2 1.1.1.3 Receptores opioides 10 1.1.1.4 Ligandos sintéticos 15 1.1.1.5 Funciones del sistema opioide 18 1.1.2 Desarrollo 18 1.1.2.1 Desarrollo de los péptidos opioides 19 1.1.2.2 Desarrollo de los receptores opioides 20 1.1.3 Plasticidad 22 1.1.4 Sistema opioide y nocicepción 26 1.1.4.1 Modulación del dolor por el sistema opioide 26 1.1.4.2 Mecanismos no opioidérgicos 32 1.1.4.3 Pruebas nociceptivas 35 1.2 Interacciones sistema opioide-monoaminas . 39 1.3 Sistema opioide y comportamiento 45 1.4 Papel del sistema opioide en el desarrollo neurobiológico y somático 51 II. OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL 54 III. MATERIAL Y MÉTODOS .. 58 111.1 Animales y condiciones experimentales . 58 111.2 Valoración de los receptores y nocicepción 61 111.2.1 Efectos del aislamiento sexual en el desarrollo 61 111.2.1.1 Aislamiento sexual 61 111.2.1.2 Valoración de los receptores ,u: ensayos de unión de ligando a receptorin varo 62 111.2.1.3 Determinación de proteínas en el homogenado 64 111.2.1.4 Pruebas nociceptivas 66 111.2.1.5 Grupos experimentales 69 111.2.2 Efectos del aislamiento sexual y la B-FNA 70 111.2.2.1 Aislamiento sexual y tratamiento farmacológico 70 111.2.2.2 Valoración de los receptores y ensayos de unión de ligando a receptorin varo 71 111.2.2.3 Determinación de proteínas en el homogenado 72 111.2.2.4 Pruebas nociceptivas 72 111.2.2.5 Grupos experimentales 73 111.3 Interacciones SOE-sistemas monoaminérgicos 77 111.3.1 Tratamiento con naltrexona 77 111.3.2 Disección de las regiones encefálicas 78 111.3.3 Valoración de las aminas biógenas por HPLC 79 111.3.4 Grupos experimentales 81 111.4 Estudios comportamentales 84 111.4.1 Tratamiento con naltrexona 84 111.4.2 Aparatos 84 111.4.2.1 Tablero de agujeros 85 111.4.2.2 Campo abierto 85 111.4.2.3 Laberinto en cruz 86 111.4.3 Técnicas experimentales 90 111.4.3.1 Tablero de agujeros 91 111.4.3.2 Campo abierto 94 111.4.3.3 Laberinto en cruz 96 111.4.4 Grupos experimentales 98 111.5. Seguimiento se parámetros relacionados con el desarrollo neurobiológico y somático . í(U 111.5.1 Estimación del ADN, proteínas y peso del cerebelo, número de núcleos y razón contenido de proteínas por núcleo RU 111.5.1.1 Determinación de la concentración de ADN 101 111.5.1.2 Determinación de la concentración de proteínas 103 111.5.1.3 Cálculo del número de núcleos y de la razón contenido de proteínas por núcleo 104 111.5.2 Aparición de la apertura ocular bilateral 106 111.5.3 Consumo alimentario y de bebida 106 111.5.4 Evolución ponderal 107 111.6 Análisis estadístico 108 111.6.1 Valoración de receptores ji proteínas y nocicepción . 108 111.6.1.1 Efectos del aislamiento sexual en el desarrollo . 108 111.6.1.2 Efectos del aislamiento sexual y la B-FNA . 109 111.6.2 Interacciones SOE-sistemas monoaminérgicos 110 111.6.3 Estudios comportamentales 111 111.6.4 Seguimiento de parámetros relacionados con el desarrollo neurobiológico y somatico 113 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 115 IV.1 Valoración de receptores y y nocicepción 115 IV.l.l Aislamiento sexual 115 IV. 1.1.1 Efectos sobre el desarrollo del receptor ji y contenido de proteínas 115 IV.1.1.2 Efectos sobre las respuestas nociceptivas 119 IV.I.1.3 Gráficas y tablas 123 IV.l.1.4 Discusion 127 IV.1.2 Aislamiento sexual y B-FNA 135 IV.1.2.1 Efectos sobre el receptor ji y contenido de proteínas 135 IV. 1.2.2 Efectos sobre las respuestas nociceptivas 139 IV.l.2.3 Gráficas y tablas 142 IV.l.2.4 Discusión 150 IV.2 Interacciones SOE-sistemas monoaminérgicos: tratamiento con naltrexona 162 IV.2.1 Efectos a los 7 días de edad 162 IV.2.2 Efectos a los 14 días de edad 163 IV.2.3 Efectos a los 22 días de edad 168 IV.2.4 Efectos en la edad adulta 170 IV.2.5 Perfil de desarrollo de las variables estudiadas 171 IV.2.6 Tablas y gráficas 180 IV.2.7 Discusión IV.4 Estudios comportamentales: tratamiento con naltrexona 216 IV.3.l Tablero de agujeros • 216 IV.3.2 Campo abierto • .