THESIS/THÈSE To obtain the title of/Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE GRENOBLE Discipline/Spécialité : Cell Biology/Biologie cellulaire Arrêté ministériel : 7 août 2006 Presented by/Présentée par Jordi Xiol Thesis supervisor/Thèse dirigée par Ramesh Pillai Thesis prepared at/Thèse préparée au sein du European Molecular Biology Laboratory (EMBL), Grenoble Outstation In/dans l'École Doctorale de Chimie et Sciences du vivant Functional studies on piRNA pathway components MOV10L1 and FKBP6 Études fonctionelles sur les composants de la voie des piRNA MOV10L1 et FKBP6 Public defense/Thèse soutenue publiquement le 08/06/2011 Jury members/devant le jury composé de: Dr. Julius Brennecke Rapporteur Prof. René Ketting Rapporteur Dr. André Verdel Examinateur Prof. Winfried Weissenhorn Président Summary Piwi-interacting RNAs (piRNAs) associate to members of the PIWI clade of Argonaute proteins and are responsible for silencing of transposable elements in animal germ lines. In mouse, PIWI proteins mediate DNA methylation at the level of transposon promoters and are required for male fertility. piRNAs are produced through two biogenesis pathways, known as primary processing and ping-pong amplification cycle. This study focuses on the functions of two PIWI-associated proteins: the putative RNA helicase MOV10L1 and the immunophilin FKBP6. Here, the role of MOV10L1 as a primary piRNA processing factor is described. Genetic disruption of MOV10L1’s RNA helicase domain results in male-specific sterility and derepression of retrotransposons due to reduction of DNA methylation. A complete loss of piRNAs is observed in the mutant, pointing to a pivotal role of MOV10L1 in piRNA biogenesis. Tdrd1 associates with PIWI proteins and has been suggested to play a role in the piRNA pathway by recruiting some factor through its N-terminal MYND domain. We show that Tdrd1’s MYND domain interacts with FKBP6, which belongs to a family of prolyl isomerases present in chaperone complexes. Biochemical studies suggest that FKBP6 is inactive and uses its prolyl isomerase domain as a structural module for binding PIWI proteins, while binding Hsp90 through its TPR domain. Analysis of an Fkbp6 mutant mouse reveals transposon derepression and loss of DNA methylation, but little defects in primary piRNA biogenesis. These results are consistent with a role of FKBP6 downstream of Tdrd1, and we speculate that it might recruit Hsp90 to PIWI complexes to mediate ping-pong amplification cycle. 3 Résumé Les piwi-interacting RNAs (piRNA) interagissent avec les protéines qui font partie de la branche PIWI de la famille des Argonautes. Ils participent à la répression des transposons dans la ligne germinale. Chez la souris, les protéines PIWI sont indispensables pour la fertilité des mâles et sont responsables de la méthylation de l’ADN au niveau des promoteurs des transposons. Les piRNA sont produis à partir de deux mécanismes: la biogenèse primaire et le cycle d’amplification ping-pong. Nous avons fait des études fonctionnelles sur deux protéines qui participent à la voie des piRNA: l’hélicase d’ARN MOV10L1 et l’immunophiline FKBP6. Nous avons décrit le rôle de MOV10L1 en tant que facteur de biogenèse primaire. La disruption génétique du domaine hélicase de MOV10L1 mène à une activation des transposons et à une perte de la méthylation de l’ADN. Ainsi, les piRNA ne sont pas produits chez le mutant, ce qui suggère que MOV10L1 est essentielle pour la biogenèse des piRNA. Tdrd1 interagit avec les protéines PIWI et joue un rôle dans la voie des piRNA en recrutant quelques facteurs à partir de son domaine MYND N-terminal. Nous avons montré que le domaine MYND de Tdrd1 interagit avec FKBP6, une protéine qui appartient à une famille d’isomérases de prolines qui sont présentes dans des complexes de chaperonnes. Les études biochimiques réalisées indiquent que FKBP6 est inactive et qu’elle utilise son domaine isomérase comme un module structural qui interagit avec les protéines PIWI, alors qu’elle interagit avec Hsp90 avec son domaine TPR. L’analyse d’une souris mutante pour Fkbp6 a révélé une dérépression des transposons et une perte de la méthylation de l’ADN, mais peu d’effets sur la biogenèse primaire. Ces résultats sont en accord avec un rôle de FKBP6 en aval de Tdrd1, et nous pouvons penser que ce rôle pourrait être le recrutement de Hsp90 pour participer au cycle d’amplification ping-pong. 4 Abbreviations Ago Argonaute Armi Armitage ATP adenosine triphosphate Aub Aubergine CDS coding sequence Cyp cyclophilin DNA deoxyribonucleic acid ds double-stranded DTT dithiotreitol DUF domain of unknown function EDTA ethylendiaminetetraacetate FKBP FK506-binding protein FL full-length GST glutathione S-transferase GTP guanosine triphosphate Hsp Heat-shock protein IPTG isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside ITC isothermal titration calorimetry kDa kilodalton L liter L1 Line1 M molar miRNA microRNA ml milliliter mM millimolar MOV10 Moloney leukemia virus 10 MOV10L1 MOV10-like 1 mRNA messenger RNA MYND myeloid, Nervy and DEAF-1 NLS nuclear localisation signal nm nanometer 5 nM nanomolar nt nucleotides ORF open reading frame PAGE polyacrylamide gel electrophoresis PAZ Piwi/Argonaute/Zwille PBS phosphate buffered saline PCR polymerase chain reaction piR-IL piRNA intermediate-like molecule piRNA piwi-interacting RNA PIWI P-element induced wimpy testis pNA p-nitroanilide PPIase prolyl cis-trans isomerase RISC RNA-induced silencing complex RNA ribonucleic acid RNP ribonucleoprotein RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction SDS sodium dodecylsulfate siRNA small-interfering RNA ss single-stranded Tdrd1 Tudor domain containing 1 TEV Tobacco Etch Virus TPR tetratricopeptide repeat UTR untranslated region v/v volume (of solute) per volume (of solvent) Zuc Zucchini μl microliter μM micromolar 6 Table of Contents _____________________________________________________________________ TABLE OF CONTENTS Summary .................................................................................................... 3 Résumé ....................................................................................................... 4 Abbreviations ............................................................................................ 5 1-INTRODUCTION ............................................................................... 11 Résumé du chapitre “Introduction” (French) ..................................................... 12 1.1 - Small non-coding RNAs ................................................................................ 13 1.1.1 - The Argonaute family of proteins ............................................................. 14 1.1.2 - Small-interfering RNAs (siRNAs) ............................................................ 16 1.1.2.1 - Biogenesis ........................................................................................... 16 1.1.2.2 - Function .............................................................................................. 20 1.1.3 - MicroRNAs (miRNAs) ............................................................................. 22 1.1.3.1 - Biogenesis ........................................................................................... 22 1.1.3.2 - Function .............................................................................................. 25 1.1.3.3 - Physiological Relevance ..................................................................... 27 1.2 - Piwi-interacting RNAs (piRNAs) .................................................................. 29 1.2.1 - Discovery and General Features ............................................................... 29 1.2.2- Biogenesis .................................................................................................. 33 1.2.2.1 - Primary Pathway ................................................................................. 33 1.2.2.2 - Secondary piRNA Biogenesis ............................................................ 37 1.2.2.3 - Compartmentalization of Biogenesis Pathways ................................. 40 1.2.3 - Function ..................................................................................................... 43 1.2.3.1 - Transposon Silencing ......................................................................... 43 1.2.3.2 - Protein-Coding Gene Silencing .......................................................... 45 7 Table of Contents _____________________________________________________________________ 1.2.3.3 - Others .................................................................................................. 46 1.3 - Aim of the Thesis ............................................................................................ 47 2- MATERIALS AND METHODS ....................................................... 49 2.1 - Clones .............................................................................................................. 51 2.1.1 - Plasmids and cDNAs ................................................................................. 51 2.1.2 - Constructs .................................................................................................. 51 2.2 - Cells ................................................................................................................. 52 2.3 - In Vivo Studies ................................................................................................ 54 2.3.1 - Mouse Strains and Genotyping ................................................................. 54 2.3.2 - Antibodies