Molekulare und strukturelle Charakterisierung der Flavonolsynthase aus Citrus unshiu Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) dem Fachbereich Pharmazie der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von Frank Wellmann aus Freiburg im Breisgau Marburg/ Lahn 2002 Vom Fachbereich Pharmazie der Philipps-Universität Marburg als Dissertation am 17.12.2002 angenommen. Erstgutachter: Herr Professor Dr. Ulrich Matern Zweitgutachter: Herr Professor Dr. Alfred Batschauer Tag der mündlichen Prüfung: 18.12.2002 Wesentliche Auszüge dieser Arbeit wurden veröffentlicht in: Publikationen [1] Wellmann F., Lukacin R., Moriguchi T., Britsch L., Schiltz E. & Matern U. (2002); Functional expression and mutational analysis of flavonol synthase from Citrus unshiu. Eur. J. Biochem. 269, 1-9 [2] Lukacin R., Wellmann F., Britsch L., Martens S. & Matern U. (2002); Flavonol synthase from Citrus unshiu is a bifunctional dioxygenase. Phytochemistry, im Druck [3] Martens S., Forkmann G., Britsch L., Wellmann F., Matern U. & Lukacin R. (2002); Divergent evolution of flavonoid 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases in parsley. PNAS, submitted Poster [1] Wellmann F., Lukacin R. & Matern U. Functional characterization of flavonol synthase from Citrus unshiu; Deutsche Botanische Gesellschaft, Botanikertagung Freiburg i. Br. 2002 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis __________________________________________________________ I Abkürzungsverzeichnis_____________________________________________________ V A Einleitung ___________________________________________________________1 A 1 Struktur und physiologische Bedeutung von Flavonoiden ___________________1 A 1.1 Einfluss der Flavonoide auf die Blütenfarben______________________________1 A 1.2 Lichtabhängige Flavonoidbildung_______________________________________2 A 1.3 Flavonoide als Wachstumsregulatoren ___________________________________4 A 1.4 Rolle der Flavonoide in der Phytopathogenabwehr _________________________4 A 1.5 Bedeutung von Flavonoiden bei Pflanze - Tier Interaktionen__________________4 A 2 Humantherapeutische Bedeutung von Flavonoiden ________________________5 A 2.1 Resorption und Metabolismus von Flavonoiden____________________________5 A 2.2 Antioxidative Eigenschaften von Flavonoiden_____________________________6 A 2.3 Tumor-protektive Wirkung von Flavonoiden______________________________7 A 2.4 Immunmodulatorische Wirkung von Flavonoiden __________________________8 A 2.5 Antivirale Wirkung von Flavonoiden ____________________________________9 A 2.6 Toxizität von Flavonoiden____________________________________________10 A 3 Flavonoidbiosynthese ________________________________________________11 A 3.1 Ort der Biosynthese _________________________________________________11 A 3.2 Biosyntheseweg____________________________________________________11 A 4 Klassifikation von Oxygenasen ________________________________________16 A 4.1 Allgemeine Unterscheidung von Monooxygenasen und Dioxygenasen_________16 A 4.2 Pharmazeutische Relevanz 2-Oxoglutarat-abhängiger Dioxygenasen und verwandter Nicht-Häm-Fe (II) Enzyme _________________________________19 A 4.3 Funktionelle und mechanistische Aspekte von 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenasen und verwandten Nicht-Häm-Fe (II) Enzymen_________________19 A 4.3.1 Penicillin- und Cephalosporin-Biosynthese____________________________19 A 4.3.2 Clavulansäure-Biosynthese ________________________________________20 A 4.3.3 Hydroxylierung von Prolinen und Prolylresten_________________________21 A 4.3.4 Ethylenbiosynthese_______________________________________________22 A 4.4 Flavonolsynthase ___________________________________________________22 A 4.5 Mechanismus von 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenasen_________________23 Inhaltsverzeichnis II A 5 Aufgabenstellung ____________________________________________________26 B Material ____________________________________________________________28 B 1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien________________________________28 B 2 Enzyme ____________________________________________________________29 B 3 Antiseren und Proteine _______________________________________________29 B 4 Membranen ________________________________________________________29 B 5 Dünnschichtplatten und Laufmittel_____________________________________29 B 6 Geräte _____________________________________________________________30 B 7 Stämme von E. coli __________________________________________________30 B 8 Vektoren___________________________________________________________30 B 9 Puffer und Lösungen_________________________________________________31 B 10 Medien ____________________________________________________________33 C Methoden___________________________________________________________34 C 1 Allgemeine proteinbiochemische Methoden______________________________34 C 2 Allgemeine molekularbiologische Methoden _____________________________36 C 3 In vitro-Mutagenese mit Oligonukleotiden _______________________________37 C 4 Expression der FLS in E. coli__________________________________________39 C 5 Zellaufschluss_______________________________________________________41 C 6 Reinigung der heterolog exprimierten FLS ______________________________41 C 7 Aminoterminale Sequenzierung ________________________________________42 C 8 Test auf Flavonolsynthase-Aktivität ____________________________________43 C 9 Präparative Gewinnung von Quercetin__________________________________44 C 10 Massenspektroskopie ________________________________________________45 C 11 CD-Spektroskopie ___________________________________________________45 C 12 FLS-Antiserum _____________________________________________________45 Inhaltsverzeichnis III D Ergebnisse und Diskussion __________________________________________46 D 1 FLS-Klonierung _____________________________________________________46 D 2 Heterologe Expression der FLS ________________________________________46 D 3 Test auf FLS-Aktivität _______________________________________________48 D 4 Reinigung der rekombinanten FLS _____________________________________49 D 4.1 Ammoniumsulfatfällung _____________________________________________49 D 4.2 Größenausschlusschromatographie an Fractogel EMD Bio SEC ______________49 D 4.3 Anionenaustauschchromatographie an Fractogel EMD DEAE _______________51 D 4.4 Reinigungstabelle __________________________________________________52 D 5 Biochemische Charakterisierung der rekombinanten FLS__________________54 D 5.1 Polypeptidanalyse __________________________________________________54 D 5.2 Präparativer Enzymtest ______________________________________________54 D 5.3 HPLC-Analyse ____________________________________________________55 D 5.4 Zeit- und Proteinlinearität ____________________________________________57 D 5.5 pH-Optimum ______________________________________________________58 D 5.6 Temperaturoptimum ________________________________________________60 D 5.7 Kinetische Konstanten für 2-Oxoglutarat und Fe2+_________________________60 D 5.8 Bestimmung der apparenten Michaelis Konstante für DHQ und DHK _________62 D 6 Datenbankanalyse der FLS ___________________________________________64 D 6.1 Ermittlung einer FLS-Konsensussequenz ________________________________64 D 6.2 Aminosäuresequenzanalysen__________________________________________66 D 7 In vitro-Mutagenesestudien____________________________________________67 D 7.1 Expression der FLS-Mutanten_________________________________________69 D 7.2 Reinigung der FLS-Mutanten _________________________________________70 D 7.3 Bestimmung der spezifischen Aktivitäten der FLS-Mutanten ________________71 D 8 Strukturelle Charakterisierung der FLS ________________________________72 D 8.1 CD-Spektrum der FLS_______________________________________________72 D 8.2 Serologische Verwandschaften der FLS _________________________________74 D 9 Strukturvorhersage der FLS __________________________________________75 D 10 Charakterisierung des aktiven Zentrums des FLS-Proteinmodells ___________83 Inhaltsverzeichnis IV D 11 Funktionelle Charakterisierung der FLS ________________________________85 D 11.1 Überprüfung der FLS auf ANS-Aktivität ________________________________85 D 11.2 Überprüfung der FLS auf FHT-Aktivität ________________________________86 D 11.3 Stereospezifität der FLS für Flavanon-Substrate __________________________88 E Schlussbetrachtung _________________________________________________93 E 1 Klonierung und Expression der FLS ____________________________________93 E 2 Reinigung der rekombinanten FLS _____________________________________94 E 3 Biochemische Charakterisierung _______________________________________95 E 4 Datenbankanalyse und Strukturvorhersage der FLS ______________________97 E 5 In vitro-Mutagenese__________________________________________________98 E 6 Strukturelle Untersuchungen der FLS _________________________________104 E 7 Substratspezifität der FLS ___________________________________________105 F Zusammenfassung _________________________________________________111 G Literaturverzeichnis _______________________________________________113 Abkürzungsverzeichnis V Abkürzungsverzeichnis A Absorption amp Ampicillin ANS Anthocyanidinsynthase ACV d-(L-a-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valin ATP Adenosin-5'-triphosphat BCIP 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat bp Basenpaare Bq Bequerel BSA Rinderserumalbumin cDNA komplementäre DNA Da Dalton DAOCS Deacetoxycephalosporin C-Synthase DEAE Diethylaminoethyl DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure ds doppelsträngig (double-stranded)