UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS DEPARTAMENTO BIOLOGÍA Trabajo de Tesis Doctoral Estudio de las melaninas de Pseudocercospora griseola, agente causante de la mancha angular del poroto y rol biológico. Tesista Lic. Alejandra Bárcena Director Dr. Mario, Carlos Nazareno Saparrat, Codirector Dr. Pedro Alberto Balatti Asesora académica Dra. Mariela, Bruno Año 2016 AGRADECIMIENTOS A la Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires (CICBA) y a la Comisión Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET) por las becas otorgadas. A la Universidad Nacional de La Plata, Facultad de Ciencias Exactas por permitirme realizar esta investigación. Al Dr. Mario Saparrat y el Dr. Pedro Balatti, por guiarme, enseñarme, entusiasmarme cuando los resultados eran como esperábamos, y por estimularme cuando así no era. Por cada una de nuestras discusiones para enriquecer el trabajo. Por enseñarme que la paciencia es la madre de la ciencia y el esfuerzo su padre. A la Dra. Mariela Bruno, por ser mi Asesora Académica, por escucharme, por sus palabras de aliento en los momentos más difíciles con esa ternura que la caracteriza. A la Dra. Laura López por asesorarme cuando comencé la tesis. A la Dra. Fernanda Rosas, Dra. María Mirifico, Dra Gabriela Petroselli, Dra Rosa Erra- Balsells, Dra. Ana Gennaro, Dr. José Estévez, por su colaboración con los espectros FTIR, UV MALDI-TOF, EPR, microscopía confocal, y sobre todo por la buena predisposición que siempre demostraron. A los chicos del laboratorio Carla, Darío, Ernest, Grace, Inés, Pepe, Silvina, Rocío, por estar siempre dispuestos a dar una mano en cuestiones de estadística, biología molecular, y también por los lindos momentos extra laborales. Al INFIVE y a cada uno de sus integrantes por hacer que cada día fuera un placer ir a trabajar. A Agus, Ali, Ana, Lucía, Iné, Fer, Pepe, Diego, Emi, Anita, Mari, Andre, Facu, Nico, Canari, Cristian, Diana, Laurita, Mari, Nadia, Guille, Santi, Taty, por las charlas y discusiones laborales, por compartir los almuerzos al sol (en invierno) o a la sobra (en verano en el Botánico) y cenas por fuera del trabajo con alguna que otra cervecita artesanal. A los amigos que conocí en este lugar, Agus, Emi, Santi, Pepe que sé que aunque nuestras vidas tomen rumbos distintos ellos siempre van a estar para compartir una charla, una cerveza o un momento. i A los amigos de la facultad, Ana, Cacho, Canari, Caro, Cristian, Diego, Lara, María, Pau, Tincho, de los cuales algunos también fueron compañeros de trabajo. A Ceci, Mari, Pau y Romi, por nuestras salidas y charlas. A las chicas de Maca, Carli, Dani, Pao, Tati y Vale, por sus palabras de aliento con cada uno de los capítulos que terminaba, por estar siempre por más que el tiempo y la distancia nos separan desde hace más de 10 años. A Sebastián, por ser mi compañero durante una gran parte de este camino. A Ángel, por la colaboración con las imágenes, y a él y Grace por bancarme en especial en el último tiempo. A mi familia, Papi, Mami, Dai y Nahuel por bancarse mis estados anímicos en la etapa de escritura, por interesarse y preguntar por mi trabajo. GRACIAS por acompañarme y entender mis elecciones. ii ÍNDICE AGRADECIMIENTOS .......................................................................................... i ÍNDICE ............................................................................................................... iii ÍNDICE DE TABLAS ......................................................................................... vii ÍNDICE DE FIGURAS ........................................................................................ ix ABREVIATURAS .............................................................................................. xiv RESUMEN ....................................................................................................... xvi ABSTRACT .................................................................................................... xviii CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL Introducción general ..................................................................................................... 1 1.1. Pigmentos .............................................................................................................. 4 1.2. ¿Qué son las melaninas? ...................................................................................... 6 1.3. Diversidad de melaninas ........................................................................................ 7 1.4. Características y propiedades de las melaninas .................................................. 12 1.5. Roles de las melaninas ........................................................................................ 15 1.5.1. Resistencia a estreses ambientales ............................................................. 15 1.5.2. Patogénesis y virulencia ............................................................................... 17 1.6. Sitios de deposición ............................................................................................. 19 1.7. Aplicaciones ......................................................................................................... 20 1.8. Pseudocercospora griseola: un hongo bajo estudio ............................................. 21 Hipótesis ..................................................................................................................... 24 Objetivos ..................................................................................................................... 24 CAPÍTULO II: VARIABILIDAD MORFOLÓGICA Y DEPOSICIÓN DE MELANINAS EN REPRESENTANTES DE LOS GRUPOS GÉNICOS DE PSEUDOCERCOSPORA GRISEOLA. 2.1. Introducción ......................................................................................................... 26 Objetivos ..................................................................................................................... 31 Hipótesis ..................................................................................................................... 31 2.2. Materiales y métodos ........................................................................................... 32 2.2.1. Aislamientos de Pseudocercospora griseola. ............................................... 32 2.2.2. Conservación de los aislamientos. ............................................................... 32 2.2.3. Inoculación y condiciones de cultivo de los hongos ...................................... 33 2.2.4. Estimación del crecimiento miceliar. ............................................................. 33 iii 2.2.5. Análisis de la pigmentación de las colonias. ................................................. 34 2.2.6. Análisis microscópicos de P. griseola en cultivos sólidos y en la presencia de Triciclazole. ................................................................................................................. 34 2.2.7. Análisis estadístico ....................................................................................... 36 2.3. Resultados ........................................................................................................... 37 2.3.1. Crecimiento y pigmentación de las colonias ................................................. 37 2.3.2. Análisis microscópicos de P. griseola en cultivos sólidos y en la presencia de triciclazole. ............................................................................................................. 42 2.4. Discusión ............................................................................................................. 47 CAPÍTULO III: CARACTERIZACIÓN DE LAS MELANINAS DE PSEUDOCERCOSPORA GRISEOLA 3.1. Introducción ......................................................................................................... 53 Objetivos ................................................................................................................ 55 Hipótesis ................................................................................................................ 55 3.2. Materiales y métodos ........................................................................................... 56 3.2.1. Cultivos de Pseudocercospora griseola. ....................................................... 56 3.2.2. Extracción de los pigmentos. ........................................................................ 56 3.2.3. Espectroscopía UV-visible. ........................................................................... 57 3.2.4. Espectroscopía de fluorescencia. ................................................................. 57 3.2.5. Espectroscopía de resonancia paramagnética electrónica. .......................... 58 3.2.6. Espectroscopía infrarroja transformada de Fourier. ...................................... 58 3.2.7. Determinación de grupos fenólicos. .............................................................. 59 3.2.8. Identificación de intermediarios de la síntesis de melanina por UV-MALDI MS.60 3.2.9. Actividad antioxidante de melaninas. ............................................................ 61 3.2.10. Actividad quelante de melaninas. ............................................................... 62 3.2.11. Análisis estadístico ..................................................................................... 63 3.3. Resultados ........................................................................................................... 64 3.3.1. Espectroscopía UV-visible ...........................................................................