i e l r b l a n c o l UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇAO EM GENÉTICA EVOLUTIVA E BIOLOGIA MOLECULAR Estudos citogenéticos clássicos e moleculares em espécies do gênero Harttia (Siluriformes, Loricariidae), com enfoque no papel dos DNAs repetitivos na evolução cariotípica do grupo. Daniel Rodrigues Blanco SÃO CARLOS - 2012 - ________________________________________________________________________________ Estudos citogenéticos clássicos e moleculares em espécies do gênero Harttia (Siluriformes, Loricariidae), com enfoque no papel dos DNAs repetitivos na evolução cariotípica do grupo. ____________________________________________________________ UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA EVOLUTIVA E BIOLOGIA MOLECULAR Estudos citogenéticos clássicos e moleculares em espécies do gênero Harttia (Siluriformes, Loricariidae), com enfoque no papel dos DNAs repetitivos na evolução cariotípica do grupo. DANIEL RODRIGUES BLANCO Tese de Doutorado apresentada ao programa de Pós-Graduação em Genética Evolutiva e Biologia Molecular do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal de São Carlos - UFSCar, como parte dos requisitos para a obtenção de título de Doutor em Ciências, área de concentração: Genética e Evolução. SÃO CARLOS - 2012 - Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitária/UFSCar Blanco, Daniel Rodrigues. B641ec Estudos citogenéticos clássicos e moleculares em espécies do gênero Harttia (Siluriformes, Loricariidae), com enfoque no papel dos DNAs repetitivos na evolução cariotípica do grupo / Daniel Rodrigues Blanco. -- São Carlos : UFSCar, 2013. 167 f. Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de São Carlos, 2012. 1. Citogenética de peixes. 2. Cascudo (Peixe). 3. Harttia. 4. DNA repetitivo. I. Título. CDD: 597.087322 (20a) Dedico este trabalho aos meus pais Reinaldo Jesus Blanco e Maria de Lourdes Rodrigues Blanco, e à minha namorada Lallucha pelo amor, apoio e confiança “Foco no objetivo, Força para lutar e Fé para conseguir” “Quando se tem uma meta, o que era um obstáculo passa a ser apenas uma etapa”. (Gerhard Erich Boehme) AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus, pelas oportunidades que tenho em minha vida. Gostaria de expressar meus agradecimentos aos meus pais: Reinaldo Jesus Blanco e Maria de Lourdes Rodrigues Blanco; e a minha namorada Lallucha por todo amor, carinho, dedicação, compreensão, compartilhando desde momentos de alegria até de extrema angústia. Obrigado por tudo. Amo vocês !!! Ao meu “Pai Científico”, Amigo e Orientador, Prof. Dr. Orlando Moreira Filho, obrigado por toda dedicação, pela excelente orientação, por todas as oportunidades e por sempre acreditar que seria possível! Valeu Paizão!! Ao Prof. Dr. Marcelo Ricardo Vicari, meu coorientador e amigo, obrigado pelas considerações, pelo empenho, dedicação e principalmente pela amizade. Aos professores Dr.Vladimir Pavan Margarido (UNIOESTE), Dr. Luiz Antônio Carlos Bertollo (UFSCar), Dr. Roberto Ferreira Artoni (UEPG), Dra Viviane Nogaroto (UEPG) e Dra Mara Almeida (UEPG) pelas sugestões, companherismo e pela oportunidade de convívio. Ao professor Dr. Pedro Galetti Jr. pelos poucos momentos, porém de fundamental importância. Ao Dr. Osvaldo T. Oyakawa, por estar sempre à disposição para identificar e depositar os exemplares de Harttia, assim como pela amizade. Gostaria de agradecer ao meu “irmão” Roberto L. Lui, pela parceria e pelo enriquecimento pessoal e profissional oriundo do convívio fora e dentro do laboratório. Valeu Fiiiiii!!! Gostaria de agradecer aos amigos de laboratório: Josi, Juliana, Marcelo e Eli, pela amizade, pelos momentos de ajuda, descontração e pelo empenho em formar um grupo de citogenética. Aos amigos e técnicos de laboratótio e coleta Pedro Gallo (Cocó) e Luiz Henrique (Piau), obrigado por não medir esforços nas coletas e pela amizade que se fortalece a cada dia. À Prof. Dr. Angélica Maria Penteado Martins Dias e ao Prof. Dr. Manuel Martins Dias Filho do INCT Hympar Sudeste da Universidade Federal de São Carlos pela amizade e por possibilitar a obtenção de fotografias, em seu laboratório, dos exemplares sob Lupa e MEV. Gostaria de agradecer também à Dr. Luciana Bueno dos Reis Fernandes, pela autoria das mesmas. Gostaria de expressar meus sinceros agradecimentos a toda à estrutura institucional e humana que possibilitaram a realização deste trabalho. À Fundação de Amparo e à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela bolsa concedida (Processo 2009/15741-0), que muito auxiliou no desenvolvimento deste trabalho. Ao Instituto Brasileiro de meio Ambiente – IBAMA – e ao Instituto Estadual de Floresta – IEF- MG, pela autorização a apoio na coleta dos exemplares. Ao Programa de Pós-graduação em Genética e Evolução, ao Laboratário de Citogenética de Peixes do Departamento de Genética e Evolução da Universidade Federal de São Carlos pelo suporte e auxílio no desenvolvimento deste trabalho. DADOS CURRICULARES DO AUTOR DANIEL RODRIGUES BLANCO – Nascido em 4 de Novembro de 1981, na cidade de São Carlos, SP, Brasil. Iniciou sua graduação na Universidade Estadual Paulista – UNESP, campus Rio Claro e após dois anos concluídos tranferiu-se para o curso de Licenciatura e Bacharelado em Ciências Biológicas da Universidade Federal de São Carlos – UFSCar, graduando-se em dezembro de 2007. Durante a graduação foi bolsista de Iniciação Científica CNPq/PIBIC em 2005 e, posteriormente, bolsista FAPESP em 2006 e 2007. Tornou-se Mestre em 2010 com a dissertação intitulada: “Caracterização citogenética em populações alopátricas do gênero Hoplias (Characiformes, Erythrinidae), com enfoque nos grupos malabaricus e lacerdae” (FAPESP - Proc: 2007/57301-1) e defendida, sob orientação do Prof. Dr. Orlando Moreira Filho (UFSCar) e co-orientaçao do Prof. Dr. Luiz Antonio Carlos Bertollo (UFSCar), junto ao programa de Pós-Graduação em Genética e Evolução da UFSCar, com menção de Louvor. Em seguida ingressou no Doutorado pelo mesmo programa, sob orientação do Prof. Dr. Orlando Moreira Filho (UFSCar) e co-orientação do Prof. Dr. Marcelo Ricardo Vicari (UEPG), sendo bolsista FAPESP. Durante esse período, participou de vários projetos de pesquisa coordenados por seu orientador e co-orientador. Apresenta 13 artigos publicados em periódicos da área e 1 aceito. Orientou uma monografia. Participou de 14 eventos científicos da área, nos quais apresentou 45 trabalhos. Ministrou dois cursos de curta duração e participou como membro efetivo de 2 bancas de TCC. Sumário Lista de Figuras ....................................................................................................................................... I Lista de Tabelas .................................................................................................................................... IV Resumo ................................................................................................................................................... V Abstract ............................................................................................................................................... VII 1. Introdução ........................................................................................................................................... 1 1.1. Aspectos gerais da família Loricariidae e da subfamília Loricariinae ...................................... 1 1.2. Estudos citogenéticos em Loricariidae, com enfoque em Loricariinae .................................... 3 1.3. Citogenética do gênero Harttia .................................................................................................. 4 1.4. DNA repetitivo .......................................................................................................................... 6 2. Justificativa ....................................................................................................................................... 11 3. Objetivos ........................................................................................................................................... 12 4. Materiais / Métodos .......................................................................................................................... 13 4.1. Metodologia Clássica .............................................................................................................. 16 4.1.1. Tratamento “in vivo” ............................................................................................................ 16 4.1.2. Tratamento “in vitro” ........................................................................................................... 17 4.1.3. Bandeamento C .................................................................................................................... 18 4.1.4. Caracterização das Regiões Organizadoras de Nucéolos (RONs) ....................................... 18 4.2. Metodologia Molecular ........................................................................................................... 19 4.2.1. Extração de DNA com tampão salino .................................................................................. 19 4.2.2. Sequênciamento nucleotídico ............................................................................................... 19 4.2.3. Análise das sequências nucleotídicas ................................................................................... 19 4.2.1. Dupla Hibridização in situ Fluorescente