3 Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” Identificação de gêneros arbóreos de Fabaceae, Lauraceae Myrtaceae do Estado de São Paulo utilizando o marcador molecular rbcl Renata Moreira Barroso Tese apresentada para obtenção do título de Doutora em Ciências, Programa: Recursos Florestais. Opção em: Conservação de Ecossistemas Florestais Piracicaba 2017 2 Renata Moreira Barroso Engenheira Florestal Identificação de gêneros arbóreos de Fabaceae, Lauraceae e Myrtaceae do Estado de São Paulo utilizando o marcador molecular rbcL versão revisada de acordo com a resolução CoPGr 6018 de 2011 Orientador: Prof. Dr. VINICIUS CASTRO SOUZA Tese apresentada para obtenção do título de Doutora em Ciências, Programa: Recursos Florestais. Opção em: Conservação de Ecossistemas Florestais Piracicaba 2017 2 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação DIVISÃO DE BIBLIOTECA – DIBD/ESALQ/USP Barroso, Renata Moreira Identificação de gêneros arbóreos de Fabaceae, Lauraceae e Myrtaceae do Estado de São Paulo utilizando o marcador molecular rbcl/ Renata Moreira Barroso. - - versão revisada de acordo com a resolução CoPGr 6018 de 2011. - - Piracicaba, 2017. 119 p. Tese (Doutorado) - - USP / Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”. 1. Flora brasileira 2. Identificação molecular 3. Banco de dados 4. Diversidade de espécies I. Título 3 AGRADECIMENTOS Meu principal agradecimento ao meu orientador e Taxonomista renomado, Vinicius Castro Souza, professor e amigo desde 2002, que me incentivou nesta pesquisa e me proporcionou esta incrível experiência e aprendizado de desenvolver um projeto de Doutorado. Agradeço à CAPES que me proporcionou a Bolsa de Doutorado durante 3 anos e à FAPESP pelo apoio a este projeto através do Auxilio pesquisa (2011/22923-8) “Utilização de sequências de marcadores moleculares na identificação de espécies arbóreas do Estado de São Paulo”. Meu eterno agradecimento aos meus pais Wilson Barroso e Juracy Barroso, ao meu irmão Alexandre Barroso pelo apoio e paciência comigo durante os anos do Doutorado. Agradeço imensamente ao Prof. Dr. Antônio Salatino e a Profa. Dra. Maria Luiza Salatino do Instituto de Biociências da USP que tornaram possível a realização desta pesquisa no Laboratório de Fitoquímica. Também agradeço imensamente a Pós-doutoranda Anary Priscila Monteiro Egidio, que com toda paciência me ensinou a manusear os equipamentos do laboratório, a realizar todos os procedimentos e reações da extração de DNA até a difícil tarefa do sequenciamento do marcador molecular. Agradecimento especial à simpática Tatiana Caroline Silveira Corrêa do Laboratório de Genômica e elementos de Transposição (GATE) que recebia minhas reações de sequenciamento e com todo cuidado me entregava os arquivos com as sequencias prontas. Também agradecimento especial a Mourisa Maria de Souza Ferreira responsável pelo laboratório de Fitoquimica, que se dedica à organização do lab e tornou possível meu trabalho no Laboratório. Agradeço muito Gabriel Colleta que com sua pesquisa de mestrado ajudou a enriquecer o banco de sequencias rcbL aqui criado compartilhando sequências de espécies arbóreas das três famílias aqui estudadas. Agradeço a Danielle Muniz, ao 4 Rubens Coelho e ao Thiago Flores por também terem ajudado no trabalho de laboratório que tornaram possível a obtenção dessas sequências compartilhadas. Agradeço muito os queridos colegas de laboratório que me forneceram ajuda necessária à realização desta pesquisa: Alexandre Gibau Lima e Carol Delfini. Aos colegas que me ajudaram na checagem das identificações: Cássio Toledo, Danilo Gissi e também à Priscila Orlandini, Marianna Conceição Rodrigues e Juliana Kuntz Galvão pelas boas conversas e risadas. Agradeço muito também ao Professor Dr. Gabriel Rodrigues Alves Margarido do Laboratório de Bioinformática do Departamento de Genética (ESALQ-USP) e aos seus alunos de pós-graduação Guilherme Hosaka e Fernando Correr pela ajuda prestada nas análises realizadas no programa BLAST. Agradecimento especial aos especialistas que me ajudaram na identificação de espécies: Fiorella Mazine, Karinne Valdemarin, Jair de Faria, Juliana Rando e Elvia Souza. À minha astróloga Andréa Righetto, que desde o começo do primeiro ano de Doutorado me mostrou as tendências astrológicas boas e ruins que afetaram o andamento desta pesquisa e nos últimos meses me incentivou, com muitas broncas, a finalizar o cumprimento deste estudo superior. Às minhas amigas mais queridas também Mestras e Doutoras, que ao longo desses anos de convivência e de muitos cafés da tarde, tornaram possível a troca de momentos alegres, experiências e lamentos tanto da vida pessoal quando da vida acadêmica: Cintia Munch Cavalcanti, Letícia Corrêa, Luciane De Gaspari, Renata Morelli, Fernanda de Moraes, Thalita Oliveira, Patricia Cursi, Caroline de Oliveira De Favari. 5 SUMÁRIO RESUMO……………………………………………………………………………………….6 ABSTRACT ..................................................................................................................... 7 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 9 2. OBJETIVOS .............................................................................................................. 23 3. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 25 3.1. COLETA DE MATERIAL BOTÂNICO PARA A CRIAÇÃO DO BANCO DE SEQUÊNCIAS DE RBCL LOCAL ......... 25 3.2. COLETA DE MATERIAL BOTÂNICO PARA O TESTE CEGO DE IDENTIFICAÇÃO............................................ 26 3.3. TRABALHO DE LABORATÓRIO .................................................................................................................... 27 3.4. EXTRAÇÃO DE DNA .................................................................................................................................. 27 3.5. AMPLIFICAÇÃO DO MARCADOR RBCL........................................................................................................ 28 3.6. PURIFICAÇÃO DA PCR .............................................................................................................................. 29 3.7. VERIFICAÇÃO DO ÊXITO DA EXTRAÇÃO, AMPLIFICAÇÃO E PURIFICAÇÃO ................................................ 29 3.8. SEQUENCIAMENTO DO RBCL .................................................................................................................... 29 3.9. EDIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE RBCL .......................................................................................................... 30 3.10. REDUÇÃO DO TAMANHO DAS SEQUÊNCIAS DO TESTE CEGO DE IDENTIFICAÇÃO ................................... 31 3.11. CRIAÇÃO DO BANCO DE SEQUÊNCIAS DE RBCL LOCAL ......................................................................... 31 3.12. ANÁLISE DE IDENTIFICAÇÃO DO TESTE CEGO NO BLAST DO BANCO DE SEQUÊNCIAS DE RBCL LOCAL E NO BLAST DO BOLDSYSTEMS ...................................................................................................................... 32 3.13. ANÁLISE DA PORCENTAGEM DE CORRETA IDENTIFICAÇÃO (PCI) ......................................................... 33 4. RESULTADOS .......................................................................................................... 34 4.1. EXTRAÇÃO, AMPLIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO DO RBCL ..................................................................... 34 4.2. CRIAÇÃO DO BANCO DE SEQUÊNCIAS DE RBCL LOCAL ........................................................................... 35 4.3. TESTE CEGO DE IDENTIFICAÇÃO NO BANCO DE SEQUÊNCIAS LOCAL ..................................................... 41 4.4. TESTE CEGO DE IDENTIFICAÇÃO COM A SEQUÊNCIA DE RBCL FRAGMENTADA ........................................ 46 4.5. RESULTADOS DO TESTE CEGO DE IDENTIFICAÇÃO NO BANCO DE SEQUÊNCIAS PÚBLICO BOLDSYSTEMS .......................................................................................................................................................................... 49 5. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 53 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................... 57 REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 59 APÊNDICES .................................................................................................................. 76 6 RESUMO Identificação de gêneros arbóreos de Fabaceae, Lauraceae e Myrtaceae do Estado de São Paulo utilizando o marcador molecular rbcL O Brasil, como país detentor da maior biodiversidade mundial de plantas, possui um importante papel no desenvolvimento de pesquisas que auxiliem ou viabilizem a identificação de sua diversidade vegetal, como o estudo de marcadores moleculares adequados a esta tarefa. Fabaceae, Lauraceae e Myrtaceae são as famílias mais importantes da Flora Brasileira por apresentarem grande diversidade de gêneros e espécies e serem consideradas de difícil identificação pela taxonomia tradicional. Tendo em vista o potencial do rbcL na identificação molecular de plantas, este trabalho propôs estudar a eficiência deste marcador em identificar gêneros e espécies das três principais famílias de árvores da Flora do Estado de São Paulo. Foi criado um banco de sequências de rbcL contendo 160 espécies, o qual foi testado quanto sua eficiência de identificação através