Facultat de Biociències Departament de Genètica i de Microbiologia Grup de Mutagènesi DAÑO GENÉTICO EN MADRES Y EN SUS RECIÉN NACIDOS. FACTORES MODULADORES Tesis doctoral Naouale El-Yamani DAÑO GENÉTICO EN MADRES Y EN SUS RECIÉN NACIDOS. FACTORES MODULADORES El presente trabajo se ha realizado en el Grup de Mutagènesi del Departament de Genètica i de Microbiologia de la Universitat Autònoma de Barcelona bajo la dirección del Dr. Ricard Marcos y subvencionado por el Proyecto de Investigación NewGeneris: Newborns and Genotoxic Exposure Risks (Food-CT-2005-016320). Memoria presentada por Naouale El-Yamani para optar al grado de Doctora por la Universitat Autònoma de Barcelona Bellaterra (Cerdanyola del Vallés), Noviembre de 2011. V°B° Autora Director del trabajo de Tesis Dr. Ricard Marcos Dauder Naouale El-Yamani Catedrático de Genética UAB No existen más que dos reglas para escribir: tener algo que decir y decirlo. Oscar Wilde (1854-1900) A mi familia Agradecimientos Este trabajo de Tesis realizado en la Universitat Autònoma de Barcelona es un esfuerzo en el cual, directa o indirectamente, participaron distintas personas opinando, corrigiendo, teniéndome paciencia, dando ánimo, acompañando en los momentos de crisis y en los momentos de felicidad. Este trabajo me ha permitido aprovechar la competencia y la experiencia de muchas personas que deseo agradecer en este apartado. En primer lugar, a mi director de Tesis, Dr. Ricard Marcos Dauder, mi más amplio agradecimiento por haberme confiado este trabajo en persona, por su paciencia ante mi inconsistencia, por su valiosa dirección y apoyo para seguir este camino de Tesis y llegar a la conclusión del mismo. Cuya experiencia y educación han sido mi fuente de motivación y de curiosidad durante estos años Al Prof. Andrew Collins, un especial agradecimiento primero por haberme recibido en su grupo de investigación en la Universidad de Oslo. Segundo, por sus consejos y su gran sabiduría y paciencia, apoyo y ánimo que me brindó durante mi estancia donde he podido tener la oportunidad de aprender y acabar una parte de este trabajo. Mis agradecimientos a la colaboración del equipo involucrado en la toma, procesado de las muestras y el análisis de los CFA de este estudio de biomonitoreo y que hicieron posible la realización de esta Tesis. Desde luego, mis agradecimientos a Glòria, Lourdes y Cristian por el espíritu de grupo, paciencia y por el incondicional apoyo durante estos años de trabajo. A Susana Pastor, por el apoyo y la coordinación y la buena gestión de toda la información necesaria. Todos mis compañeros y amigos, estén donde estén, y sin excepción tanto del grup Mutas como los Fanconi, se merece muchas y buenas palabras, ya que con ellos he compartido despacho, laboratorio e incontables horas de trabajo y buenos ratos, lo cual no tiene precio. Por todo el tiempo que me han dado, por las conversaciones científicas de las que tanto provecho he sacado, por el respaldo y la amistad. Gracias por los buenos y malos momentos, por aguantarme y por escucharme. Siempre estuvieron ahí en lo bueno y en lo malo, en ocasiones con más confianza en el trabajo que yo misma. ¿Quien puede pedir más? Nos hemos dado ánimos por el camino, y eso siempre ayuda. A todos ellos, g r a c i a s . Un especial agradecimiento a Jaouad, Ali, Med, Alba, Bere, Romain, Lorena y Ana, por estar siempre a mi lado. No puedo olvidar en mis agradecimientos a la gente de fuera, Amaia, Yolanda y Marit, que me han recibido muy bien durante mi estancia y por haberme dado la oportunidad de convivir dentro y fuera. Todo esto nunca hubiera sido posible sin el amparo incondicional que me otorgaron y el cariño que me inspiraron mis padres, que, de forma incondicional, entendieron mis ausencias y mis malos momentos. Que a pesar de la distancia siempre estuvieron a mi lado para saber cómo iba mi proceso. Las palabras nunca serán suficientes para testimoniar mi aprecio y mi agradecimiento. A todos ustedes, mi mayor reconocimiento y gratitud Índice Índice ABREVIATURAS ....................................................................................................................................... i 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................ 1 1.1. Riesgos de exposición medioambiental en niños ...................................................................... 3 1.2. Riesgos de exposición medioambiental prenatal ...................................................................... 5 1.3. Asociación entre exposición prenatal y enfermedades en la niñez .................................... 6 1.4. Períodos críticos y de vulnerabilidad durante el desarrollo fetal ....................................... 9 1.5. Papel de la circulación transplacentaria ...................................................................................... 11 1.6. Modelos para el estudio del metabolismo y de la transferencia placentaria ............... 14 1.7. Biomonitorización humana .............................................................................................................. 17 1.8. Biomarcadores ....................................................................................................................................... 19 1.8.1. Biomarcadores de exposición ................................................................................................. 21 1.8.2. Biomarcadores de efecto ........................................................................................................... 21 1.8.3. Biomarcadores de susceptibilidad ........................................................................................ 22 1.9. Efectos genéticos de la exposición a los contaminantes ambientales ............................. 23 1.9.1 El estrés oxidativo ......................................................................................................................... 24 1.9.2. Mecanismos de reparación del daño genético ................................................................. 27 1.10. Ensayo del cometa como biomarcador del riesgo genotóxico ......................................... 31 1.10.1. Ensayo del cometa en estudios de genotoxicidad ....................................................... 33 1.10.2. Ensayo del cometa en los estudios de reparación del DNA ..................................... 33 1.11. Cuestiones éticas relacionadas con la biomonitorización humana ............................... 35 1.12. Nutrición y su papel modulador del daño genético ............................................................. 36 1.12.1. Exposición transplacentaria a contaminantes de la dieta ........................................ 37 1.12.2. Factores que reducen el riesgo de la exposición prenatal ....................................... 41 1.12.3. La dieta mediterránea como ejemplo de un patrón dietético saludable ............ 43 2. OBJETIVOS ........................................................................................................................................ 47 3. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................... 49 a Índice 3.1. Población estudiada ............................................................................................................................. 49 3.2. Colección de las muestras de sangre ............................................................................................. 49 3.3. Aislamiento y congelación de los linfocitos................................................................................ 51 3.4. Descongelación de las muestras ..................................................................................................... 53 3.5. Ensayo del cometa ................................................................................................................................ 53 3.5.1. Descripción del protocolo estándar ..................................................................................... 53 3.5.1.1. Preparación del micro-gel de agarosa ............................................................................. 53 3.5.1.2. Lisis ................................................................................................................................................. 55 3.5.1.3. Desnaturalización y electroforesis .................................................................................... 56 3.5.1.4. Neutralización y fijación ........................................................................................................ 56 3.5.1.5. Tinción y visualización ........................................................................................................... 56 3.5.2. Ensayo del cometa para la detección de bases oxidadas ............................................. 57 3.5.3. Ensayo del cometa para el estudio de la reparación ..................................................... 58 3.5.3.1. Preparación de los substratos ............................................................................................. 60 3.5.3.2. Preparación de los extractos proteicos ........................................................................... 61 3.5.3.3. Incubación del extracto proteico con el substrato celular ...................................... 62 3.5.3.4. Estimación de las proteínas totales en los extractos ................................................. 64 3.6. Desarrollo, colección y análisis de los cuestionarios .............................................................