Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München Vorkommen von Anaplasma phagocytophilum und Babesia spp. in Rehwild (Capreolus capreolus), Damwild (Dama dama) und Muffelwild (Ovis musimon) in Deutschland von Melanie Christin König, geb. Kauffmann aus Gräfelfing München 2017 Aus dem Veterinärwissenschaftlichen Departement der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München Lehrstuhl für Vergleichende Tropenmedizin und Parasitologie Arbeit angefertigt unter der Leitung von Priv.-Doz. Dr. Cornelia Silaghi Gedruckt mit der Genehmigung der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München Dekan: Univ.-Prof. Dr. Reinhard K. Straubinger, PhD Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. Cornelia Silaghi Korreferent: Priv.-Doz. Dr. Bianka Schulz Tag der Promotion: 29. Juli 2017 Für Andreas Inhaltsverzeichnis V INHALTSVERZEICHNIS I. EINLEITUNG ..................................................................................... 1 II. LITERATURÜBERSICHT ............................................................... 4 1. Pathogene ............................................................................................. 4 1.1. Anaplasma phagocytophilum ................................................................ 4 1.1.1. Taxonomie ............................................................................................. 4 1.1.2. Vektor .................................................................................................... 5 1.1.3. Historie .................................................................................................. 6 1.1.4. Klinik ..................................................................................................... 7 1.1.5. Reservoirwirte ....................................................................................... 8 1.1.6. Genetische Variabilität ........................................................................ 12 1.2. Babesia spp. ........................................................................................ 13 1.2.1. Taxonomie ........................................................................................... 13 1.2.2. Entwicklungszyklus, Vektor ............................................................... 14 1.2.3. Historisches ......................................................................................... 16 1.2.4. Klinik ................................................................................................... 16 1.2.5. Babesia spp. in Wildwiederkäuern...................................................... 18 III. MATERIAL UND METHODEN .................................................... 20 1. Proben ................................................................................................ 20 2. DNA Extraktion................................................................................. 22 3. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ............................................... 22 3.1. Anaplasma phagocytophilum .............................................................. 22 3.1.1. Real-time-PCR .................................................................................... 22 3.1.2. Nested PCR ......................................................................................... 23 3.2. Babesia spp. ........................................................................................ 24 3.3. Theileria spp. ....................................................................................... 24 4. Agarose-Gelelektrophorese .............................................................. 25 5. Sequenzanalyse .................................................................................. 26 6. Statistik ............................................................................................... 26 IV. ERGEBNISSE ................................................................................... 28 1. Publikation ......................................................................................... 28 V. DISKUSSION .................................................................................... 58 Inhaltsverzeichnis VI 1. Anaplasma phagocytophilum ............................................................ 58 2. Babesia spp. ........................................................................................ 62 3. Theileria spp. ...................................................................................... 65 4. Coinfektionen ..................................................................................... 66 VI. SCHLUSSFOLGERUNG ................................................................. 68 VII. ZUSAMMENFASSUNG .................................................................. 69 VIII. SUMMARY........................................................................................ 71 IX. LITERATURVERZEICHNIS ......................................................... 73 X. ANHANG ........................................................................................... 95 1. Abbildungen ....................................................................................... 95 2. Tabellen .............................................................................................. 95 3. Material .............................................................................................. 96 3.1. Geräte .................................................................................................. 96 3.2. Kits ...................................................................................................... 96 3.3. Nukleotide, Primer .............................................................................. 96 3.4. Chemikalien ........................................................................................ 97 XI. DANKSAGUNG ................................................................................ 98 Abkürzungsverzeichnis VII ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS A. Anaplasma mM Milimolar Abb. Abbildung N Anzahl B. Babesia NCBI National Center for bp Basenpaar Biotechnology BLAST Basic local alignment Information search tool ng Nanogramm bzw. beziehungsweise Nr./no. Nummer °C Grad Celcius nos. Nummern ca. Cirka PCR Polymerase-Ketten- Reaktion (englisch: CGA Canine granulozytäre Polymerase chain Anaplasmose reaction) cm3 Kubikzentimeter PBS Phosphatgepufferte Salzlösung Ct-Wert Schwellenwert-Zyklus sek Sekunde d.h. das heißt sp. Species DNA Desoxyribonukleinsäure spp. species (Plural) dNTP Desoxyribonukleosid- Tab. Tabelle triphosaphate Taq Thermus aquaticus EGA Equine granulozytäre TBF Tick-borne-fever Anaplasmose U Einheit (englisch: unit) H2O Wasser UV Ultraviolett HGA Humane granulozytäre Anaplasmose I. Ixodes msp Oberflächenprotein (englisch: major surface protein) µl Mikroliter µm Mikrometer µM Mikromolar min/min. Minute mm Millimeter mm3 Kubikmillimeter I. Einleitung 1 I. EINLEITUNG Das Zusammenspiel von Pathogenen, Zecken und deren Wirten ist für die Verbreitung von zecken-übertragenen Krankheiten verantwortlich. Einige Wirte ermöglichen den Krankheitserregern eine Weiterentwicklung und Vermehrung ohne selbst Schaden zu nehmen oder Krankheitssymptome zu entwickeln und gelten somit als Reservoirwirte. In Mitteleuropa ist der gemeine Holzbock Ixodes ricinus die am weitesten verbreitete Schildzeckenart. Diese ist unter anderem als Vektor für Anaplasma phagocytophilum und Babesia spp. bekannt, die als sogenannte „emerging pathogens“ gelten. Das heißt, sie fallen durch ein zunehmendes Auftreten auf und betreffen als Zoonoseerreger sowohl Tiere als auch den Menschen. Beim Menschen können sie zu Erkrankungen führen, die im Schweregrad stark variieren. Auch bei Haus- und Nutztieren sind unterschiedliche schwere Krankheitsverläufe bekannt, wobei bei letzteren eine Erkrankung fast immer mit wirtschaftlichen Einbußen einhergeht (Deplazes et al., 2012; Homer et al., 2000; Stuen et al., 2013a; Woldehiwet, 2010). Babesien sowie A. phagocytophilum wurden bereits in Wildtieren nachgewiesen. Die Bandbreite reicht dabei bei A. phagocytophilum von kleinen Nagetieren über Wildwiederkäuer bis hin zu großen Raubtieren wie dem Braunbär (Obiegala et al., 2014; Stuen et al., 2013a; Vichova et al., 2010). Aufgrund der vielen Babesienarten ist auch die Bandbreite unterschiedlicher Wirte entsprechend groß. Von den über 100 bekannten Arten wurden sechs bereits in europäischen Wildwiederkäuern molekularbiologisch nachgewiesen: Babesia capreoli, Babesia divergens, Babesia bigemina, Babesia motasi, Babesia ovis und Babesia venatorum (Synonym: Babesia sp. EU1). Zusätzlich sind auch Varianten mit geringen genetischen Abweichungen wie Babesia odocoilei-like, Babesia sp. MO1 und Babesia sp. CH1 in früheren Studien erwähnt (Duh et al., 2005; Enigk und Friedhoff, 1962b; Homer et al., 2000; Michel et al., 2014; Overzier et al., 2013a; Silaghi et al., 2011a; Tampieri et al., 2008; Zanet et al., 2014). Bei früheren Studien fielen dabei zum Teil sehr hohe Prävalenzen in Wildwiederkäuern auf, so dass einige Autoren diese als mögliche Reservoirwirte für einige der oben genannten Babesienarten sowie für A. phagocytophilum I. Einleitung 2 vorschlugen (Alberdi et al., 2000; Overzier et al., 2013a; Silaghi et al., 2011a; Zintl et al., 2003). Das Vorkommen schwankt jedoch stark je nach Erreger- und Wildwiederkäuerart. Beispielsweise in Italien wurde für A. phagocytophilum eine Prävalenz für Rehe von 54,2% nachgewiesen; bei Damwild und Muffelwild aus der gleichen Region wurde der Erreger nicht gefunden.