Aus dem Lehrstuhl für Innere Medizin I Prof. Dr. med. Jürgen Schölmerich Der Medizinischen Fakultät Der Universität Regensburg Untersuchung der Expression und Regulation von Komponenten des Inflammasoms in primären intestinalen Epithelzellen, Zelllinien, sowie bei Patienten mit Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Inaugural – Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Regensburg vorgelegt von Johann Federhofer 2009 Aus dem Lehrstuhl für Innere Medizin I Prof. Dr. med. Jürgen Schölmerich Der Medizinischen Fakultät Der Universität Regensburg Untersuchung der Expression und Regulation von Komponenten des Inflammasoms in primären intestinalen Epithelzellen, Zelllinien, sowie bei Patienten mit Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Inaugural – Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Regensburg vorgelegt von Johann Federhofer 2009 Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Bernhard Weber 1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Dr. phil. Gerhard Rogler 2. Berichterstatter: PD Dr. med. Stefan Farkas Tag der mündlichen Prüfung: 29.09.2010 The mere formulation of a problem is often far more essential than its solution, which may be merely a matter of mathematical or experimental skill. To raise new questions, new possibilities, to regard old problems from a new angle requires creative imagination and marks real advances in science. (Albert Einstein) Für meine Eltern und Elisabeth Inhaltsverzeichnis VII Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ................................................................................................ VII Abbildungsverzeichnis ..........................................................................................IX Tabellenverzeichnis .................................................................................................X 1 Einleitung .......................................................................................................... 1 1.1 Gastrointestinaltrakt.............................................................................................. 1 1.2 Aufbau der Darmwand ......................................................................................... 3 1.2.1 Dünndarm.................................................................................................................... 5 1.2.2 Dickdarm ..................................................................................................................... 5 1.3 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen ........................................................ 6 1.3.1 Colitis ulcerosa ............................................................................................................ 6 1.3.2 Morbus Crohn.............................................................................................................. 7 1.3.3 Genetik und Pathophysiologie chronisch entzündlicher Darmerkrankungen ............. 8 1.3.4 Angeborene Immunität des Darms............................................................................ 10 1.4 Aktivierung des Inflammasoms.......................................................................... 13 2 Arbeitsziele...................................................................................................... 16 3 Material ........................................................................................................... 18 3.1 Zellkultur ............................................................................................................ 18 3.2 Epithelzellisolation ............................................................................................. 18 3.3 Zellkulturstimulation .......................................................................................... 19 3.4 RNA-Isolation..................................................................................................... 19 3.5 RNA-Konzentrationsbestimmung ...................................................................... 19 3.6 RT-PCR .............................................................................................................. 19 3.7 Qualitative PCR.................................................................................................. 19 3.8 Gelelektrophorese ............................................................................................... 21 3.9 Quantitative PCR (Taqman® PCR)..................................................................... 21 4 Methoden......................................................................................................... 23 4.1 Zellkultur ............................................................................................................ 23 Inhaltsverzeichnis VIII 4.1.1 Epithelzelllinien......................................................................................................... 23 4.1.2 Isolation primärer humaner intestinaler Epithelzellen............................................... 26 4.1.3 Stimulation primärer humaner intestinaler Epithelzellen.......................................... 26 4.1.4 Zellkulturstimulation ................................................................................................. 27 4.2 Nukleinsäuretechniken ....................................................................................... 29 4.2.1 Gesamt-RNA-Isolation.............................................................................................. 29 4.2.2 RNA-Konzentrationsbestimmung ............................................................................. 29 4.2.3 RT-PCR ..................................................................................................................... 30 4.2.4 Polymerse Kettenreaktion (PCR) .............................................................................. 30 4.2.5 Gelelektrophorese...................................................................................................... 32 4.2.6 Quantitative PCR (Taqman® PCR) ........................................................................... 33 5 Ergebnisse........................................................................................................ 36 5.1 Qualitative NALP-Expressionsuntersuchung in HT29- und CaCo2-Zellen ...... 36 5.2 Quantitative NALP-Expressionsuntersuchung................................................... 39 5.2.1 Primervalidierung...................................................................................................... 39 5.2.2 NALP-Expression in HT29-, CaCo2-, T84-, SW480- und primären IEZ................. 40 5.3 Stimulationsversuche.......................................................................................... 46 5.3.1 Stimulation primärer intestinaler Epithelzellen......................................................... 46 5.3.2 Stimulation von HT29-Zellen.................................................................................... 52 5.3.3 Stimulation von HT29-Zellen mit IFNγ Vorstimulation........................................... 54 5.4 Expressionsuntersuchung von NALP2 und 3 bei MC und UC Patienten .......... 64 6 Diskussion........................................................................................................ 67 6.1 NALP-Expression in verschiedenen Zellen........................................................ 67 6.1.1 Zelllinien.................................................................................................................... 68 6.1.2 Primäre intestinale Epithelzellen............................................................................... 70 6.2 Stimulationsversuche.......................................................................................... 72 6.2.1 Stimulation primärer intestinaler Epithelzellen......................................................... 72 6.2.2 Stimulation von HT29-Zellen.................................................................................... 74 6.2.3 Stimulation von HT29-Zellen mit IFNγ Vorstimulation........................................... 75 6.3 Expressionsuntersuchung von NALP2, 3 bei MC und UC Patienten ................ 76 7 Zusammenfassung .......................................................................................... 78 8 Literaturverzeichnis....................................................................................... 80 Abbildungsverzeichnis IX Abbildungsverzeichnis 1.1 Schichtenbau der verschiedenen Abschnitte des Gastrointestinaltrakts .......................... 3 1.2 Lokalisation der Schleimhautläsionen bei UC und MC .................................................. 7 1.3 NALP1 und NALP2/3 Inflammasom ............................................................................ 11 1.4 CATERPILLER Proteinfamilie mit ihren 4 Untergruppen ........................................... 12 1.5 Schematischer Weg der NALP3 Inflammasomaktivierung........................................... 14 4.1 HT29-Zellen .................................................................................................................. 24 4.2 CaCo2-Zellen................................................................................................................. 24 4.3 T84-Zellen ..................................................................................................................... 25 4.4 SW480-Zellen................................................................................................................ 25 4.5 Schrittweiser Ablauf einer PCR....................................................................................