SCUOLA DI DOTTORATO IN SANITÀ E PRODUZIONI ANIMALI: SCIENZA,DIPARTIMENTO TECNOLOGIA DI SCIENZE E BIOTECNOLOGIE ANIMALI DOTTORATO DI RICERCA IN PRODUZIONI ANIMALI ANIMALI RICERCA E VALIDAZIONE DI SNP IN GENI CANDIDATI PER LA QUALITÀ DELLA CARNE E APPLICAZIONE DELL’ANALISI GENOMICA ALLA SPECIE SUINA Tesi di: Marta Raschetti Docente guida: Giulio Pagnacco Correlatore: Bianca Castiglioni Ciclo: XXIII Anno accademico 2009-2010 Università degli Studi di Milano Facoltà di Medicina Veterinaria Dipartimento di Scienze e tecnologie veterinarie per la Sicurezza Alimentare Scuola di dottorato di ricerca in ―Sanità e Produzioni Animali: Scienze, Tecnologia e Biotecnologia‖ RICERCA E VALIDAZIONE DI SNP IN GENI CANDIDATI PER LA QUALITÀ DELLA CARNE E APPLICAZIONE DELL’ANALISI GENOMICA ALLA SPECIE SUINA Curriculum: Metodologie e biotecnologie applicate alla genetica animale Docente Tutor: Prof. Giulio Pagnacco Correlatore: Bianca Castiglioni Dott.ssa Marta Raschetti Matricola: R07789 Homo Faber Fortunae Suae Sommario SUMMARY ......................................................................................................................................... 1 PREMESSA E SCOPO DEL LAVORO ............................................................................................. 3 INTRODUZIONE ................................................................................................................................ 4 La Suinicoltura Italiana ........................................................................................................................ 5 Patrimonio suinicolo e andamento del mercato ............................................................................... 5 Sistema italiano di produzione suinicola ......................................................................................... 7 Tecniche di allevamento dei suini .................................................................................................... 8 Tipi genetici utilizzati per la produzione di duino pesante e leggero ............................................ 11 Large White italiana ................................................................................................................... 12 Landrace italiana ........................................................................................................................ 13 Landrace belga ........................................................................................................................... 13 Duroc .......................................................................................................................................... 14 Pietrain italiana .......................................................................................................................... 15 Razze a limitata diffusione in Italia ............................................................................................... 15 Hampshire italiana ..................................................................................................................... 15 Spot ............................................................................................................................................ 16 Razze autoctone e Registro Anagrafico ......................................................................................... 17 Cinta Senese ............................................................................................................................... 18 Mora Romagnola........................................................................................................................ 18 Nero di Sicilia ............................................................................................................................ 19 Casertana .................................................................................................................................... 19 Apulo-Calabrese......................................................................................................................... 20 Sarda........................................................................................................................................... 21 Il Tipo Genetico Nero di Parma ................................................................................................. 22 Il Tipo Genetico Suino Nero di Garlasco................................................................................... 23 Disciplinare del Libro Genealogico e del Registro Anagrafico della Specie Suina ...................... 24 La tipicità della selezione italiana .................................................................................................. 25 Fattori che influenzano la qualità della carne ................................................................................ 31 La selezione assistita da marcatori (MAS) e la sua integrazione nei piani di selezione ................ 32 Il Genoma Suino ................................................................................................................................ 38 Analisi molecolare del genoma suino: dai QTL ai sistemi high-throughput di genotipizzazione . 42 Il genome scanning nel suino ......................................................................................................... 43 L‟approccio del gene candidato nel suino ...................................................................................... 46 Nuove strategie per identificare i geni responsabili di caratteri complessi mediante l'analisi funzionale del genoma ................................................................................................................... 52 Applicazioni di genomica funzionale per l'identificazione di geni per la qualità della carne ....... 54 SNP discovery: approcci molecolari tradizionali per la rilevazione di mutazioni puntiformi ....... 55 SNP discovery: tecnologie di sequenziamento massivo dei genomi ............................................. 56 Metodi di genotipizzazione a bassa e media densità nel suino ...................................................... 58 Metodi di genotipizzazione ad alta/altissima densità nelle specie di interesse zootecnico ........... 59 Prospettive per la selezione nella specie suina............................................................................... 63 MATERIALI E METODI .................................................................................................................. 65 Ricerca e validazione di SNP in geni candidati per la qualità della carne suina ............................... 66 Campionamento ............................................................................................................................. 66 Raccolta dei fenotipi e del materiale biologico .......................................................................... 66 Scelta dei caratteri fenotipici e degli animali per le successive sperimentazioni ...................... 68 Preparazione degli acidi nucleici per le analisi .......................................................................... 69 Analisi Molecolari.......................................................................................................................... 73 Disegno dei primer per l‟amplificazione a partire dal cDNA .................................................... 73 Disegno di nuovi primer per l‟amplificazione a partire dal DNA ............................................. 84 Analisi molecolare mediante la tecnica PCR-SSCP .................................................................. 93 Sequenziamento ......................................................................................................................... 95 Analisi Statistiche e bionformatiche .............................................................................................. 95 Analisi delle sequenze ................................................................................................................ 95 Tipizzazione dei polimorfismi identificati ................................................................................. 95 Studi di associazione polimorfismo-fenotipo ............................................................................ 96 Analisi genomica della specie suina .................................................................................................. 97 Campionamento ............................................................................................................................. 97 Preparazione degli acidi nucleici per le analisi .......................................................................... 97 Analisi Molecolari.......................................................................................................................... 97 Analisi Statistiche e bionformatiche .............................................................................................. 98 RISULTATI ....................................................................................................................................... 99 Ricerca e Validazione di SNP in geni candidati per la qualità della carne suina ........................ 100 Scelta dei geni per l‟analisi sperimentale ................................................................................. 100 Scelta dei campioni per l‟analisi sperimentale ......................................................................... 101 Strategia di scelta dei campioni ..............................................................................................