Université de Sherbrooke “Modulation of the neurotensin receptor type I by pepducins mimicking its first intracellular loop” By German de Armas-Guitart Pharmacology Program Thesis presented to the Faculty of Medicine and Health Sciences for the obtention of the Master of Science (M. Sc.) degree in Pharmacology Sherbrooke, Quebec, Canada April 2021 Members of evaluation jury Philippe Sarret, Pharmacology Michel Grandbois, Pharmacology Mannix Auger-Messier, Pharmacology Xavier Roucou, Biochemistry German de Armas-Guitart, 2021 I RÉSUMÉ Modulation du récepteur de la neurotensine de type 1 par des pepducines mimant sa première boucle intracellulaire.’’ Par German de Armas-Guitart Programme de pharmacologie Mémoire présenté à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention du diplôme de maîtrise en pharmacologie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4 Le récepteur de la neurotensine de type 1 (NTS1) appartient à la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), qui après son interaction avec son ligand peut exercer différents effets physiologiques tels qu’analgésie, hypothermie et hypotension. La diversité des réponses physiologiques possibles indique que plusieurs voies de signalisation sont activées et que plusieurs effecteurs cytosoliques sont impliqués. Des études précédentes menées avec des conjugués lipopeptidiques, dont la partie peptidique imite la première boucle intracellulaire (ICL1) de NTS1 (également appelées pepducines), ont montré que certaines voies de signalisation sont favorisées ou inhibées, démontrant l'influence de ces conjugués sur l'interaction avec les effecteurs cytosoliques et sur la modulation des voies de signalisation. De plus, l'évaluation in vivo de cette pepducine dans des modèles de douleur aiguë, douleur tonique et douleur chronique a révélé un effet antinociceptif ainsi qu'une forte capacité à diminuer la pression artérielle. Dans cette étude, nous avons évalué l'effet de l'augmentation de l’hydrophobicité des pepducines sur leurs activités biologiques. En conséquence, nous avons généré une série de pepducines basées sur la séquence de ICL1 de NTS1 dans laquelle chaque acide aminé a été remplacé par un tryptophane. L'impact de l’introduction du tryptophane dans la séquence lipopeptidique de nos pepducines a été évalué en mesurant la réponse cellulaire globale par un essai d’impédance électrique. Le profil de signalisation de nos pepducines a aussi été déterminé à l'aide de biosenseurs spécifique BRET (Gα13, Gαq et β-arrestines 1 et 2), qui ont révélé une probable modulation allostérique biaisée. En effet, la substitution de certains résidus semble favoriser l'activation des voies de signalisation Gα13 et Gαq sans recrutement des β-arrestines 1 et 2. De façon intéressante, en utilisant la neurotensine radiomarquée dans un test de liaison compétitif sur le récepteur hNTS1, nous avons également démontré que nos pepducines pouvaient induire le déplacement d’un ligand orthostérique via un site allostérique probablement placé à la surface intracellulaire du récepteur. Enfin, les composés les plus puissants des tests in vitro ont été évalués dans un modèle de douleur aiguë (test de retrait de la queue). L'administration intrathécale des pepducines PP-W11 à 275 nmol/kg a induit une réponse antinociceptive puissante qui a surpassé toutes les réponses analgésiques rapportées par toutes pepducines synthétisées jusqu'à présent. Ces résultats ont confirmé que l'augmentation du potentiel hydrophobe de PP-ICL1 pourrait constituer une approche intéressante dans le raffinement des propriétés des pepducines de NTS1 ainsi que dans la découverte de nouveaux candidats médicaments. II SUMMARY “Modulation of the neurotensin receptor type I by pepducins mimicking its first intracellular loop” By German de Armas-Guitart Pharmacology Program Thesis presented to the Faculty of Medicine and Health Sciences for the obtention of the Master of Science (M. Sc.) degree in Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4 The neurotensin receptor type I (NTS1) belongs to the G protein coupled receptor (GPCR) superfamily, which induces after ligand-receptor interaction different physiological effects, such as analgesia, hypothermia, and hypotension. The diversity in the physiological response reveals that several pathways are being activated and that several cytosolic effectors are also involved. Previous studies conducted with lipopeptide conjugates whose peptide portion mimics the first intracellular loop (ICL1) of NTS1 (also known as pepducins) have shown that some pathways are favored or inhibited, demonstrating the influence of these ICLs on the interaction with the cytosolic effectors and in the modulation of signaling pathways. The evaluation of this pepducin (PP-ICL1) in acute, tonic, and chronic pain models has revealed that the activation of the Gα13 and Gαq proteins signaling pathway could be associated with an antinociceptive action. In this study, we have evaluated the effect of enhancing the hydrophobic properties in punctual positions of PP-ICL1 sequence on its biological potential. Accordingly, we synthetized a series of pepducins based on the sequence of PP-ICL1 in which each amino acid was substituted by tryptophan. The whole cellular response induced by our pepducins was monitored using electrical cell impedance sensing and used to evaluate the effect of the tryptophan introduction. The signaling profile of the pepducins was determined using BRET biosensors, which revealed a biased modulation. Indeed, the substitution of certain residues seemed to favor the engagement of the Gα13 and Gαq signaling pathways without causing any effect on the recruitment of β- arrestins 1 and 2. Using a radiolabeled probe in a competitive radioligand binding assay on the hNTS1 receptor, we demonstrated that our pepducins could displace the bounded orthosteric ligand by probably acting in an allosteric site. Finally, the most potent compounds of this series tested in vitro were screened in a model of an acute pain model (tail-flick test). Intrathecal administration of pepducins PP-W11 at 275 nmol/kg induced a potent antinociceptive response which outperformed all the analgesic responses reported by any pepducin synthesized so far. Taken together, these results confirm that enhancing selectively the hydrophobic potential of PP-ICL1 could constitute a valid approach in the refinement of these pepducin properties as well as in the discovery of new drugs candidates. III TABLE OF CONTENTS RÉSUMÉ ............................................................................................................................................... II SUMMARY .......................................................................................................................................... III TABLE OF CONTENTS .......................................................................................................................... IV LIST OF FIGURES ................................................................................................................................ VII LIST OF TABLES ................................................................................................................................. VIII LIST OF ABBREVIATIONS ..................................................................................................................... IX Remerciement .................................................................................................................................... XI INTRODUCTION ................................................................................................................................... 1 1.1 Transduction of biochemical signals by cell membrane receptors ........................................... 1 1.1.1 G protein-coupled receptors (GPCRs) ................................................................................ 1 1.1.2 GPCR structures and classification ..................................................................................... 1 1.1.3 GPCR activation .................................................................................................................. 3 1.1.4 Rearrangement associated with GPCR activation .............................................................. 5 1.1.5 Intracellular structural elements involved in the activation of the G proteins .................. 6 1.1.6 Heterotrimeric G proteins and functional cycle ................................................................. 7 1.1.7 Canonical G protein signaling pathways ............................................................................ 8 1.1.8 β-arrestin signaling ............................................................................................................. 9 1.1.9 Receptor oligomerization ................................................................................................. 11 1.2 The neurotensinergic system and the NTS1 receptor ............................................................. 12 1.2.1 Neurotensin discovery, structure, and biosynthesis ........................................................ 12 1.2.2 Discovery and distribution ............................................................................................... 13 1.2.3 NT receptors ....................................................................................................................