Aus der Klinik fur¨ Anasthesiologie¨ der Ludwig-Maximilians-Universitat¨ Munchen¨ Direktor: Herr Prof. Dr. med. Bernhard Zwißler Die protektive Wirkung von Quercetin-3-glucuronid bei xenogener Herztransplantation im ex vivo Perfusionsmodell Dissertation zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Fakultat¨ der Ludwig-Maximilians-Universitat¨ zu Munchen¨ vorgelegt von Regina Elisabeth Ebert aus Fulda 2015 Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultat¨ der Universitat¨ Munchen¨ Berichterstatter: Herr Priv.-Doz. Dr. med. Andreas Bauer Mitberichterstatter: Herr Prof. Dr. med. Michael Schmoeckel Herr Priv.-Doz. Dr. med. Stephan Lederer Dekan: Herr Prof. Dr. med. Dr. h. c. M. Reiser, FACR, FRCR Tag der mundlichen¨ Prufung:¨ 18.06.2015 2 Inhaltsverzeichnis Abkurzungsverzeichnis¨ 6 Abbildungsverzeichnis 8 Tabellenverzeichnis 10 1 Einleitung 11 1.1 Relevanz der Xenotransplantation fur¨ die Herztransplantationsmedizin . 11 1.1.1 Problematik des Organspendemangels . 11 1.1.2 Definition und Entwicklung der Xenotransplantation . 13 1.1.3 Das Schwein als Spender fur¨ die Xenotransplantation . 14 1.2 Hyperakute Abstoßungsreaktion . 15 1.3 Ischamie-/Reperfusionsschaden¨ . 18 1.4 Working-Heart-Modell . 19 1.5 Flavonoide . 20 1.5.1 Wirkungsmechanismen von Flavonoiden . 22 1.5.2 Spezifische Wirkungsmechanismen von Quercetin-3-glucuronid . 24 1.6 Fragestellung der vorliegenden Arbeit . 27 2 Material und Methoden 28 2.1 Versuchsgruppen . 28 2.2 Operatives Vorgehen . 28 2.2.1 Anasthesie¨ . 28 2.2.2 Operation . 29 2.2.3 Herzpraparation¨ . 31 3 2.3 Working-Heart-Modell . 32 2.3.1 Aufbau . 34 2.3.2 Perfusat . 35 2.4 Versuchsablauf . 37 2.5 Messparameter . 38 2.5.1 Funktionsparameter . 38 2.5.1.1 Hamodynamik¨ . 38 2.5.1.2 O2-Verbrauchskalkulation . 39 2.5.2 Blutgasanalyse . 40 2.5.3 Hamatologie¨ . 40 2.5.4 Laborparameter . 40 2.5.4.1 Myokardlasion¨ . 40 2.5.4.2 Anti-pig-Antikorper¨ . 41 2.5.4.3 IL-6 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) . 41 2.5.5 Herzgewicht . 42 2.6 Statistik . 43 3 Ergebnisse 44 3.1 Antikorperbindung¨ . 44 3.2 Leukozytenzahl . 45 3.3 Thrombozytenzahl . 46 3.4 Entzundungsmediatoren¨ . 46 3.5 Herzgewicht . 48 3.6 Hamodynamische¨ Parameter . 49 3.6.1 Mittlerer arterieller Blutdruck . 49 3.6.2 Links-atrialer Druck . 50 3.6.3 Herzzeitvolumenindex . 50 3.6.4 Schlagarbeitsindex . 51 3.7 Myokardlasion¨ . 52 3.8 Myokardialer Metabolismus . 54 3.8.1 Venose¨ Laktatkonzentration . 54 4 3.8.2 Arteriovenose¨ Sauerstoffgehaltsdifferenz . 55 3.8.3 Koronarer Blutflussindex . 56 3.8.4 Myokardiale Effizienz . 57 4 Diskussion 59 4.1 Einfuhrung¨ . 59 4.2 Wirkung von Quercetin-3-glucuronid im xenogenen Working-Heart-Modell 59 4.2.1 Immunologische und inflammatorische Reaktion . 59 4.2.2 Herzfunktion . 63 4.2.3 Myokardlasion¨ und myokardialer Metabolismus . 65 4.3 Limitationen des verwendeten Working-Heart-Modells . 67 4.4 Relevanz von Quercetin-3-glucuronid fur¨ die Xenotransplantation . 69 5 Zusammenfassung 74 Literaturverzeichnis 77 Danksagung 90 Eidesstattliche Versicherung 92 Publikationen 93 5 Abkurzungsverzeichnis¨ ABF arterieller Blutfluss AHXR acute humoral xenograft rejection APA Anti-pig-Antikorper¨ AVDO2 arteriovenous difference in oxygen content (arteriovenose¨ Sauerstoffge- haltsdifferenz) CaO2 arterieller Sauerstoffgehalt CBF koronarer Blutfluss CBFI koronarer Blutflussindex CK-MB-Masse Creatinkinase-MB-Masse COX-2 Cyclooxygenase 2 CvO2 venoser¨ Sauerstoffgehalt daP diastolic arterial pressure (diastolischer arterieller Blutdruck) dPmax maximum differential pressure (maximale Druckanstiegsgeschwindig- keit) ELISA Enzyme linked Immunosorbent Assay eNOS endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase Gal-AK Galα(1,3)Gal-Antikorper¨ Gal-KO α1,3-Galaktosyltransferase-Knockout-Schweine GOT Glutamat-Oxalacetat-Transaminase HAR hyperakute Abstoßungsreaktion Hb Hamoglobin¨ hCRP humanes Komplementregulatorprotein HI Herzindex HF Herzfrequenz H2O2 Wasserstoffperoxid HZV Herzzeitvolumen ICAM-1 intercellular adhesion molecule 1 IFNγ Interferon γ IL-1β, 6, 8 Interleukin 1β, 6, 8 iNOS induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase LAP left atrial pressure (links-atrialer Druck) I/R Ischamie-/Reperfusion¨ LDH Laktatdehydrogenase LPS Lipopolysaccharid maP mean arterial pressure (mittlerer arterieller Blutdruck) ME myokardiale Effizienz MVO2 myocardial oxygen consumption (myokardialer Sauerstoffverbrauch) 6 NO Stickstoffmonoxid non-Gal-AK non-Galα(1,3)Gal-Antikorper¨ O2 Sauerstoff PAF Plattchenaktivierender¨ Faktor PNAK praformierte¨ naturliche¨ Antikorper¨ pO2art arterieller Sauerstoffpartialdruck pO2ven venoser¨ Sauerstoffpartialdruck QG Quercetin-3-glucuronid = Quercetinglucuronid ROS reactive oxygen species (reaktive Sauerstoffspezies) SO2art arterielle Sauerstoffsattigung¨ SO2ven venose¨ Sauerstoffsattigung¨ saP systolic arterial pressure (systolischer arterieller Blutdruck) SC-PVO sanwich cultures of postcapillary venular origin (Sandwich-Kultur von Endothelzellen postkapillarer¨ Venolen und Perizyten) SWI stroke work index (Schlagarbeitsindex) TNFα Tumornekrosefaktor alpha VCAM-1 vascular cell adhesion molecule 1 7 Abbildungsverzeichnis 1.1 Daten von Eurotransplant zur Entwicklung der Herztransplantationen in den letzten 15 Jahren . 12 1.2 Strukturformel von Flavan . 21 1.3 Strukturformel von Quercetin . 22 1.4 Strukturformel von Quercetin-3-glucuronid . 24 2.1 Hals- und Thoraxpraparation¨ . 30 2.2 Herz in situ . 31 2.3 Prapariertes¨ Herz vor Einbau in das Working-Heart-Modell . 32 2.4 Versuchsaufbau . 33 2.5 Herz in Working-Heart-Modell . 33 2.6 Schematische Darstellung des Working-Heart-Modells . 34 2.7 Versuchsablauf . 37 3.1 Anti-pig-Antikorper¨ (APA) . 44 3.2 Leukozyten (WBC) . 45 3.3 Thrombozyten (Plt) . 46 3.4 Porcines Interleukin 6 (IL-6) . 47 3.5 Humanes Interleukin 6 (IL-6) . 47 3.6 Herzgewichtzunahme . 48 3.7 Mittlerer arterieller Druck (maP) . 49 3.8 Herzzeitvolumenindex (HI) . 50 3.9 Schlagarbeitsindex (SWI) . 51 3.10 Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) . 52 8 3.11 Laktatdehydrogenase (LDH) . 53 3.12 Creatinkinase-MB-Masse (CK-MB) . 54 3.13 Venose¨ Laktatkonzentration . 55 3.14 Arteriovenose¨ Sauerstoffgehaltsdifferenz (AVDO2)............ 56 3.15 Koronarer Blutfluss Index (CBFI) . 57 3.16 Myokardiale Effizienz (ME) . 58 9 Tabellenverzeichnis 1.1 Durchgefuhrte¨ Xenotransplantationen . 14 2.1 Beeinflussbare Parameter des Perfusats . 36 10 Kapitel 1 Einleitung 1.1 Relevanz der Xenotransplantation fur¨ die Herztrans- plantationsmedizin 1.1.1 Problematik des Organspendemangels Mit der ersten erfolgreichen Herztransplantation im Dezember 1967 schaffte Christiaan Neethling Barnard im Groote Schuur Hospital in Kapstadt einen wichtigen Durchbruch fur¨ die Transplantationsmedizin [1]. Zu diesem Zeitpunkt war die Uberlebensrate¨ der Pa- tienten sehr gering und es gab noch kein effektives Immunsuppressivum, welches diese gesteigert hatte.¨ Diese Situation anderte¨ sich durch die Entdeckung des Calcineurinin- hibitors Cyclosporin A [2, 3]. Nach dessen Einfuhrung¨ im Jahr 1983 kam es zu einem Anstieg der jahrlich¨ durchgefuhrten¨ Herztransplantationen. Im Laufe der Zeit etablierte sich die Herztransplantation zu einem Standardverfahren fur¨ die Behandlung des termina- len Herzversagens. Dieser positive Entwicklungsverlauf wird allerdings durch die enorme Problematik des Organspendemangels limitiert. Die Daten von Eurotransplant (Abbildung 1.1), eine Kooperation von acht europaischen¨ Staaten, verdeutlichen dies. Hiernach gab es im Jahr 2013 1053 Registrierungen von Pati- enten auf der Warteliste fur¨ eine Herztransplantation. Von den gelisteten Patienten erhiel- ten in diesem Jahr nur 581 ein neues Herz. Die Mortalitatsrate¨ der gelisteten Patienten, die keine Herztransplantation erhielten, lag bei 21,2%. Im Bereich der medikamentosen¨ Therapie zur Behandlung des terminalen Herzversagens 11 1400 Registrierungen von Patienten auf Warteliste Anzahl der transplantierten Herzen 1200 Mortalität der Patienten auf Warteliste 1000 800 600 Patientenzahl 400 200 0 20002001 20022003 2004 2005 20062007 2008 2009 2010 20112012 2013 Jahr Abbildung 1.1: Daten von Eurotransplant zur Entwicklung der Herztransplantationen in den letzten 15 Jahren gab es zum Beispiel durch den Einsatz von ACE-Hemmern, β -Blockern und Aldosteron- Antagonisten große Fortschritte. Auch die Entwicklungen der Kardiochirurgie im Bereich Revaskularisations-/ und Klappenchirurgie sowie der Einsatz von Herzunterstutzungssys-¨ temen, tragen zu verbesserten Therapieerfolgen bei [4]. Nach Ausschopfung¨ der vorge- nannten Therapien steht neben dem Einsatz von Kunstherzen langfristig nur die Herz- transplantation als ultima ratio zur Verfugung.¨ Dem Problem des Organmangels versucht man auf unterschiedlichen Wegen entgegenzu- wirken. Der erste und scheinbar einfachste Schritt ist der Versuch, den Anteil potentieller Organspender mit Hilfe von Transplantationsgesetzen zu erhohen.¨ Man findet hierzu in ei- nigen Landern,¨ wie zum Beispiel Osterreich¨ und Spanien, die sogenannte Widerspruchs- regelung, welche besagt, dass jeder Burger¨ bei einem arztlich¨ festgestellten Hirntod als Organspender gelten kann, solange er zu Lebzeiten diesem nicht widersprochen hat. In Deutschland trat am 01. November 2012 eine Anderung¨ des Transplantationsgesetzes in Kraft, das die Entscheidungsregelung einfuhrt¨ und die zuvor gultige¨ erweitere Zustim- mungsregelung ablost.¨ Nach der neuen Gesetzeslage wird jeder Burger¨ ab Vollendung des 12 16. Lebensjahres schriftlich durch die Krankenkassen uber¨ Organspende informiert und befragt, ob er einer Organspende zustimmt oder diese ablehnt. Eine Entscheidungspflicht besteht