University of São Paulo “Luiz de Queiroz” College of Agriculture Deciphering the role of early molecular interactions between Eucalyptus spp. x Austropuccinia psidii and its pathogenesis Isaneli Batista dos Santos Thesis presented to obtain the degree of Doctor in Science. Area: Agricultural Microbiology Piracicaba 2019 Isaneli Batista dos Santos Agronomist Engineer Deciphering the role of early molecular interactions between Eucalyptus spp. x Austropuccinia psidii and its pathogenesis versão revisada de acordo com a resolução CoPGr 6018 de 2011 Advisor: Profa. Dra. MARIA CAROLINA QUECINE VERDI Thesis presented to obtain the degree of Doctor in Science. Area: Agricultural Microbiology Piracicaba 2019 2 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação DIVISÃO DE BIBLIOTECA – DIBD/ESALQ/USP Santos, Isaneli Batista dos Deciphering the role of early molecular interactions between Eucalyptus spp. x Austropuccinia psidii and its pathogenesis / Isaneli Batista dos Santos - - versão revisada de acordo com a resolução CoPGr 6018 de 2011. - - Piracicaba, 2019. 110 p. Tese (Doutorado) - - USP / Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”. 1. Lipdômica 2. Transcriptômica 3. Fungo biotrófico 4. Mecanismo pré- formado I. Título 3 AGRADECIMENTOS “Entregue o seu caminho ao Senhor; confie nele, e ele o fará” Salmos 37:5 À Deus pelo dom da vida, pela proteção e por sempre guiar meu caminho! À minha família: Izabel, Izanielle, Jamille, Júnior e Samuel, pelo incentivo, apoio e compreensão! Ao meu noivo, Fabrício, por sempre apoiar minhas decisões, por todo amor e companherismo! À minha querida orientadora, Prof. Maria Carolina Quecine, obrigada por ser esse exemplo de pessoa e de profissionalismo! Obrigada por ter me dado a oportunidade de ser sua orientada, por não medir esforços na minha orientação, por ter me dado a chance de conviver com você e pela oportunidade de ter aprendido tanto! Você despertou em mim meu melhor lado: o cientista crítico! Sem dúvidas vc é uma inspiração pra mim! Ao Prof. João Lúcio, pelo exemplo de dedicação, humildade e profissionalismo! Aos colegas, amigos e ex-integrantes do “Laboratório de Genética de Microorganismos”, obrigada pela convivência, pelas discussões científicas, pelos ensinamentos e pela companhia! Ao grupo de pesquisa “Puccinia”, unidos e com muita garra, superamos muitos obstáculos, aprendemos muito e discutimos muita ciência. Obrigada, sem a ajuda de vocês nada disso teria sido realizado! Ao Prof. Carlos Labate, Mônica, Thaís e todos integrantes do “Laboratório Max Feffer de Genética de Plantas” pelo apoio nas análises e disponibilização de equipamentos! À Prof. Luciana D. Silva e aos técnicos Natanael e Sabino do “Viveiro de mudas do Departamento de Ciências Florestais” pelo apoio inestimável na condução de mudas e na disponibilização de material vegetal. Sem dúvidas, conviver com vocês e aprender um pouco com suas experiências foi muito valioso pra mim! À querida Lívia Franceschini, pelo apoio incondicional nas análises de RNASeq! Ao time UAG na Esalq, Arthur, Pedro, Adijailton, Bruno, Everthon e demais, obrigada pelas conversas, companhia e apoio! Aos amigos Mariana, Bruna W., Everthon, Camila, Jessica, Jaqueline, Bruno, Helena, Carolzinha e tantos outros, obrigada pela amizade e convívio, vcs foram essenciais nessa caminhada! Aos amigos, Flaviana, Tiago e Raquel, apesar da distância vocês se fizeram sempre presentes! Obrigada pela amizade! À minha querida ex orientadora, Prof. Júlia K. Sobral, pelas inúmeras conversas e pelo incentivo em cursar doutorado na Esalq. Sem seu incentivo nada disso teria acontecido! À Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola e a todos os professores dos departamentos de Solos, Genética, Fitopatologia, Ciências Florestais e Biologia, pelo auxílio em minha formação. À Capes (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelo suporte financeiro. Agradeço também a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desta tese. Obrigada! 4 “A scientist in his laboratory is not a mere technician: he is also a child confronting natural phenomena that impress him as though they were fairy tales” Marie Curie 5 CONTENTS RESUMO ............................................................................................................................................... 7 ABSTRACT ........................................................................................................................................... 8 FIGURE LIST ....................................................................................................................................... 9 TABLE LIST ....................................................................................................................................... 11 ABBREVIATION LIST ..................................................................................................................... 12 1. INTRODUCTION ........................................................................................................................... 13 REFERENCES ............................................................................................................................... 18 2. THE Eucalyptus CUTICULAR WAXES CONTRIBUTE IN PREFORMED DEFENSE AGAINST Austropuccinia psidii ........................................................................................................ 25 ABSTRACT .................................................................................................................................. 25 INTRODUCTION ........................................................................................................................... 25 MATERIALS AND METHODS ........................................................................................................ 26 o SUSCEPTIBILITY OG EUCALYPTUS SPP. TO AUSTROPUCCINIA PSIDII: FIELD INFERENCE .. 26 o A. PSIDII QUANTIFICATION BY QPCR IN CONTRASTING EUCALYPTUS SPECIES ............. 27 o EUCALYPTUS SPP. CUTICULAR WAX EXTRACTION ......................................................... 27 o CHEMICAL CHARACTERIZATION OF EUCALYPTUS SPP. CUTICULAR WAXES USING CG- TOF-MS .......................................................................................................................... 28 o INFLUENCE OF CUTICULAR WAX ON A. PSIDII GERMINATION ....................................... 29 o HEXADECANOIC ACID EFFECTS ON A. PSIDII GERMINATION ......................................... 29 o SCANNING ELECTRON MICROSCOPY ............................................................................. 29 o STATISTICAL ANALYSIS ................................................................................................. 30 RESULTS ..................................................................................................................................... 30 o EVALUATION OF THE EUCALYPTUS SPP. RUST SUSCEPTIBILITY .................................... 30 o EUCALYPTUS SPP. CUTICLE WAX CHARACTERIZATION .................................................. 33 o GERMINATION RATE OF A. PSIDII IN CUTICLE EXTRACTS AND HEXADECANOIC ACID ... 34 o EPICUTICULAR WAX MORPHOLOGY AND A. PSIDII GERMINATION IN VIVO..................... 35 DISCUSSION ................................................................................................................................ 37 CONCLUSIONS............................................................................................................................. 39 FUNDING ..................................................................................................................................... 39 ACKNOWLEDGMENTS ................................................................................................................. 40 SUPPLEMENTARY MATERIAL .................................................................................................... 40 REFERENCES ............................................................................................................................... 42 3. TRANSCRIPTOME ANALYSIS OF Austropuccinia psidii REVEALS THE ROLE OF CUTICULAR WAXES Eucalyptus spp. ON FUNGAL PATHOGEN GENE EXPRESSION .... 49 ABSTRACT .................................................................................................................................. 49 INTRODUCTION ........................................................................................................................... 50 MATERIALS AND METHODS ........................................................................................................ 52 o EXPERIMENTAL DESIGN ................................................................................................. 52 o RNA EXTRACTION, LIBRARY CONSTRUCTION AND RNA-SEQ........................................ 53 o DATA PROCESSING AND ASSEMBLY .............................................................................. 54 o DIFFERENTIALLY EXPRESSED GENES ANALYSIS, ANNOTATION AND CATEGORIZATION ....................................................................................................................................... 54 o REAL-TIME QUANTITATIVE PCR (RT-QPCR) ANALYSIS OF THE DEGS ...................... 55 RESULTS ..................................................................................................................................... 57 o EXTRACTION OF TOTAL RNA FROM UREDOSPORES OF A. PSIDII .................................... 57 o SEQUENCE ANALYZING AND ALIGNING