Universidad Nacional Mayor de San Marcos Universidad del Perú. Decana de América Facultad de Ciencias Biológicas Escuela Profesional de Genética y Biotecnología Implementación de una estrategia de clonación en E. coli de genes de Prodiplosis longifila Gagné con potencial para la producción de ARNdc en bacterias TESIS Para optar el Título Profesional de Bióloga Genetista Biotecnóloga AUTOR Mónica Carola CORREA GUERRERO ASESOR Margarita Rosa Eugenia VELÁSQUEZ REINOSO Lima, Perú 2018 ACTA DE SUSTENTACIÓN DEDICATORIA A mi padre, por ser mi ejemplo de lucha; a mi madre, por guiarme a ser soñadora, y a mis hermanas, por apoyarme y aconsejarme. AGRADECIMIENTOS A mi asesora interna Margarita Velásquez, por todas sus sugerencias y apoyo para culminar esta tesis. A mi asesor externo Luis De Stefano, por brindarme la oportunidad de realizar la tesis en el Laboratorio de Genómica Funcional – LID - UPCH. A mis amigos: Antoine Geneste y Marianella Ayala, participantes de este proyecto, con quienes compartí las frustraciones y alegrías de todos los trabajos de investigación que realizamos juntos. A la empresa CAMPOSOL S. A., por el suministro de las muestras de Prodiplosis longifila, y de los reactivos necesarios para la realización del presente trabajo. FUENTE DE FINANCIAMIENTO Fondos del contrato: 006-FINCYT-FIDECOM-PIPEA-2013 asignados al proyecto: “CONTROL DEL ATAQUE DEL DÍPTERO Prodiplosis longifila DEL CULTIVO DE ESPÁRRAGO (Asparagus officinalis) MEDIANTE LA INGESTA DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE dsARN DIRIGIDOS A GENES IMPORTANTES EN SUS DIFERENTES ESTADIOS”. ÍNDICE GENERAL Pág. 1 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1 2 MARCO TEÓRICO...................................................................................................... 3 2.1 Prodiplosis longifila Gagné ................................................................................... 3 2.2 ARN de interferencia (ARNi) ................................................................................ 5 2.3 ARNi en el control de plagas ................................................................................ 7 2.4 Administración del ARNdc al insecto .................................................................... 9 2.5 Producción del ARNdc ....................................................................................... 12 2.6 Clonación celular de ADN .................................................................................. 14 2.7 Transformación bacteriana ................................................................................. 19 3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS ....................................................................................... 20 4 MATERIAL Y MÉTODOS .......................................................................................... 21 4.1 Selección de las secuencias de los genes blancos ............................................ 22 4.2 Diseño de cebadores ......................................................................................... 23 4.3 Extracción de ARN y síntesis de ADNc .............................................................. 23 4.4 PCR de los genes blancos ................................................................................. 24 4.5 Extracción del vector Litmus 38i ......................................................................... 26 4.5.1 Extracción por lisis alcalina ......................................................................... 26 4.5.2 Extracción con kit ........................................................................................ 27 4.6 Modificación del vector ....................................................................................... 28 Pág. 4.6.1 Linearización del vector .............................................................................. 28 4.6.2 Adición de timina al vector .......................................................................... 28 4.6.3 Autoligación del vector ................................................................................ 29 4.7 Ligación del producto de PCR al vector ............................................................. 29 4.8 Obtención de bacterias transformadas con vectores recombinantes .................. 30 4.8.1 Preparación de células quimiocompetentes ................................................ 30 4.8.2 Transformación de bacterias ....................................................................... 31 4.8.3 Verificación de la presencia del inserto ....................................................... 31 4.9 Almacenaje de las bacterias transformadas ....................................................... 32 5 Resultados ................................................................................................................ 33 5.1 Obtención de cebadores de los genes blancos .................................................. 33 5.2 Extracción de ARN y síntesis de ADNc .............................................................. 34 5.3 PCR de los genes blancos ................................................................................. 37 5.4 Obtención del vector Litmus 38i modificado ....................................................... 39 5.4.1 Extracción del vector Litmus 38i .................................................................. 39 5.4.2 Modificación del vector ................................................................................ 41 5.5 Transformación de células E. coli Novablue ....................................................... 42 6 Discusión .................................................................................................................. 47 7 Conclusiones............................................................................................................. 52 8 Referencias bibliográficas ......................................................................................... 53 9 Anexos ...................................................................................................................... 60 ÍNDICE DE FIGURAS Pág. Figura 1. Esquema de larva de Prodiplosis longifila. .......................................................... 5 Figura 2. Esquema del silenciamiento mediado por ARNi. ................................................ 7 Figura 3. Formas de entregar el ARNdc al insecto el control de plagas. .......................... 12 Figura 4. Esquema de producción de ARNdc en E. coli HT115. ...................................... 14 Figure 5. Esquema del vector pLITMUS. ......................................................................... 17 Figure 6. Esquema de la clonación de genes. ................................................................. 18 Figura 7. Diagrama de flujo general de los pasos metodológicos .................................... 22 Figura 8. Medidas espectrales del ARN total aislado de larvas de P. longifila. ................ 35 Figura 9. Gel de agarosa al 1% con muestras de ARN total de larvas de P. longifila. ...... 36 Figura 10. Gel de agarosa al 1.5% con los amplicones del ADNc de P. longilia. ............. 37 Figura 11. Gel de agarosa al 1.5% con los amplicones de 16 genes blancos. ................. 38 Figure 12. Gel de agarosa al 1% con el vector Litmus 38i extraído por lisis alcalina. ....... 40 Figura 13. Gel de agarosa al 1% con el vector Litmus 38i extraído por el Kit. .................. 40 Figura 14. Gel de agarosa al 1% con vectores modificados autoligados. ........................ 41 Figure 15. Placa de agar con bacterias transformadas con vectores modificados por PCR. ......................................................................................................................................... 42 Figure 16. Placas de agar con bacterias transformadas con vectores modificados por reacción de Transferasa. .................................................................................................. 43 Figure 17. Gel de agarosa al 1.5% con con amplicones a partir de vectores extraídos de bacterias transformadas. .................................................................................................. 44 Figure 18. Gel de agarosa al 1.5% con vectores recombinantes de los genes 1.1 y 21.2, sometidos a digestión. ...................................................................................................... 45 Figura 19. Gel de agarosa al 1.5% con vectores recombiantes de los genes 21.2 y 25.1, sometidos a digestión. ...................................................................................................... 46 ÍNDICE DE TABLAS Pág. Tabla 1. Clasificación taxonómica de Prodiplosis longifila según Gagné (1986) ................ 3 Tabla 2. Componentes (A) y ciclaje (B) de la reacción de PCR de las secuencias de los genes a clonar .................................................................................................................. 25 Tabla 3. Componentes de la reacción de PCR para la modificación del vector ................ 28 Tabla 4. Componentes de la reacción de transferasa para modificación del vector ......... 29 Tabla 5. Componentes de la reacción de ligación del inserto con el vector modificado .... 30 Tabla 6. Componentes de la reacción de digestión con el vector clonado ....................... 32 Tabla 7. Cebadores de las secuencias de genes utilizados ............................................. 33 Tabla 8. Lecturas en el espectrofotómetro del vector Litmus 38i purificado ..................... 39 Tabla 9.